潘亞麗

（英科新創（廈門）科技股份有限公司，福建廈門 361022）

尿酸（Uric Acid，UA）是嘌呤堿基代謝產物，既可以來自體內，也可以來自于食物中嘌呤的分解代謝，主要在肝臟中生成，小部分尿酸可經肝臟隨膽汁排泄，其余大部分均從腎臟排泄[1]。臨床上常將血清尿酸檢測結果作為痛風、腎功能損傷診斷的一個重要指標，因此尿酸檢測在臨床上具有重要的作用[2]。尿酸濃度的升高或降低均會對機體造成不利的影響，因而尿酸的準確測定就顯得尤為重要[3]。檢測過程中，檢驗樣本的狀態對測定結果的準確性可產生嚴重影響，因此必須對檢測干擾因素進行研究。干擾物質按照來源可分為內源性物質和外源性物質。尿酸測定試劑所適用的臨床樣本一般為血清，離體的血液經不同的方法處理從而得到檢測所需的樣本。由于從全血中分離獲得，因此血液中的一些物質可能會成為潛在的內源性干擾物。本研究采用在血清樣本中添加抗壞血酸（VC），模擬人體服用維生素后的干擾物樣本；在血清樣本中添加血紅蛋白，模擬溶血的內源性干擾物樣本；在血清樣本中添加膽紅素，模擬黃疸的內源性干擾物樣本；在血清樣本中添加甘油三酯、脂肪乳，模擬脂血的內源性干擾物樣本。對在臨床工作中常見的干擾作用進行尿酸測定試劑抗干擾能力研究，以期為尿酸的測定和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所用血清樣品來源于健康體檢者，空腹狀態下靜脈采血5 mL、3 000 r/min離心5 min后得到相應血清，無脂血、溶血和黃疸血清樣本-20 ℃冰箱凍存。

1.2 儀器與試劑

尿酸測定試劑盒，英科新創（廈門）科技股份有限公司；日立7180型全自動生化分析儀，日立集團有限公司；校準品及質控品，英國朗道公司。干擾物質：抗壞血酸（VC），99.7%，默克Sigma；血紅蛋白（HB），98%，默克Sigma；膽紅素（TB），98%，Aladdin；甘油三酯（TG），99%，默克Sigma；10%脂肪乳，四川科倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 尿酸測定方法

尿酸測定試劑盒采用尿酸酶法，反應生成的紅色醌亞胺色素與樣本中尿酸的濃度成正比，測定吸光度，并計算尿酸的濃度。

1.3.2 基礎血清的制備

根據《干擾實驗指南》（WS/T 416—2013），按尿酸濃度選取2個濃度的樣本：將尿酸濃度約500 μmol/L的樣本混合，制備成高值基礎混合血清；將尿酸濃度約200 μmol/L的血清樣本混合，制備成低值基礎混合血清。

1.3.3 干擾物篩選樣本制備

根據《干擾實驗指南》（WS/T 416—2013），選擇醫學決定水平、參考范圍的上限或病理濃度，確定干擾實驗時干擾物的濃度。Vc干擾樣本的濃度為1 704 μmol/L（0.3 g/L），HB干擾樣本的濃度10 g/L，TB干擾樣本濃度為684 μmol/L，TG干擾樣本濃度為37 mmol/L，脂肪乳干擾樣本濃度為0.03%。干擾物分別配制成20倍的貯存液，將不同濃度的5種干擾物質分別與高、低混合血清按1∶19稀釋，得到10組高濃度干擾樣本。

1.3.4 干擾評價（劑量效應）樣本制備

當干擾物篩選試驗顯示被評價干擾物對尿酸有明顯干擾作用時，制備一系列不同濃度的干擾測試樣本。對照樣本（干擾物質的緩沖液與混合血清按1∶19稀釋）和干擾樣本（干擾物質貯備液與混合血清按1∶19稀釋）配制為5個濃度梯度樣本，對照樣本與干擾樣本分別按體積比例（4∶0、3∶1、2∶2、1∶3和0∶4）混合為5個濃度[4]。

1.3.5 操作

（1）在儀器狀態最佳條件下，用尿酸試劑對上述樣品進行測定。（2）每種干擾樣本均為現配現測。（3）為排除測量程序的精密度對干擾效果的影響，根據統計學檢驗的置信水平、檢驗效能及測量程序的批內精密度和干擾標準[5]，計算出dmax/S=2.5，查詢95%置信水平與檢驗效能下不同干擾標準所需要的樣品，重復測定次數為5次。（4）劑量效應試驗在同一分析批之內檢測5個樣本的濃度，第一組按照升序測定各樣本，第二組按降序測定，以此類推，從而能夠平均系統漂移產生的影響。

1.4 統計學處理

所有數據應用Microsoft Excel 2013軟件處理和作圖分析，檢測結果取均值。配對差異計算添加樣本和對照樣本測量均值差的絕對值（B），B=干擾管測定結果-對照管測定結果。判定標準：當篩選試驗顯示被評價干擾物對被評價方法有明顯干擾作用，則進一步通過劑量效應試驗確定小于偏倚臨界值（相對偏差均在±10%范圍內（干擾率≤10%），即高值差值在±50 μmol/L，低值差值在±20 μmol/L）即可接受。確定不同干擾物濃度的干擾程度，以干擾物濃度為x軸，以各干擾物濃度結果與對照樣本結果的差值為y軸，繪制散點圖，然后依次對各點進行點對點連線，采用點對點法估計不同濃度干擾物的干擾效果。計算的干擾濃度，即為該干擾物質不對分析物造成干擾的最大濃度。如果不同的分析物濃度試驗得到的可接受干擾物濃度不同，則取其中最低的可接受干擾物濃度作為最終結果。

2 結果與分析

2.1 干擾物篩選結果

通過計算添加樣本和對照樣本測量均值差的絕對值，HB、TG、脂肪乳樣本和對照樣本測量均值差＜偏倚臨界值，無明顯干擾作用。Vc、TB的測量均值差＞偏倚臨界值，VC和TB有明顯干擾作用。結果見表1。

表1 VC、HB、TB、TG、脂肪乳干擾物篩選結果（單位：μmol/L）

2.2 劑量效應試驗結果

隨著干擾物VC和TB濃度的增加，其干擾程度也逐漸增加，見表2。

表2 VC、TB干擾物干擾評價（單位：μmol/L）

2.3 VC對尿酸測定的影響

在尿酸濃度約為200 μmol/L及500 μmol/L分析水平下，VC對尿酸試劑產生負向干擾，其干擾呈非線性干擾趨勢，結果見圖1（a）和圖1（b）。低值樣品（約200 μmol/L）回歸方程為y=-0.022x-2.912，高值樣品（約500 μmol/L）回歸方程為y=-0.040 5x-3.152，干擾效果可以從圖1中進行估計，也可以通過回歸方程計算。通過斜率和截距關系，計算出低值樣本VC的干擾劑量為686.1 μmol/L，高值樣本VC的干擾劑量為1 072.4 μmol/L，則本實驗中當血清中VC≤686 μmol/L不影響尿酸試劑的測定結果。

圖1 VC劑量效應回歸分析

2.4 TB對尿酸測定試劑的影響

在尿酸濃度約為 200 μmol/L及 500 μmol/L分析水平下，TB對尿酸試劑也產生負向干擾。其干擾呈非線性干擾趨勢，結果見圖2（a）和圖2（b）。低值樣品（約200 μmol/L）回歸方程為y=-0.0706x+2.608，高值樣品（約500 μmol/L）回歸方程為y=-0.0831x+2.22，干擾效果可以從圖2中進行估計也可以通過回歸方程計算。通過斜率和截距關系，計算出低值樣本TB的干擾劑量為368.4 μmol/L，高值樣本TB的干擾劑量為617.3 μmol/L，則本實驗中當TB≤368 μmol/L不影響尿酸試劑的測定結果。

圖2 TB劑量效應回歸分析

3 結論

由于人體血清成分復雜，其中的某些成分會引起試劑盒測定的干擾。本實驗只選取了5種干擾物質，在尿酸濃度約為200 μmol/L及約500 μmol/L分析水平下，當HB≤10 g/L，TG≤37 mmol/L，脂肪乳≤0.03%時，尿酸測定結果不受影響，即干擾率≤ 10%。 當 Vc≤ 686 μmol/L，TB≤ 368 μmol/L時,計算得到的相對偏差均在士10%范圍內，為臨床可接受范圍，且此時VC的干擾濃度大于《干擾實驗指南》(WS/T 416—2013)中表C規定的最高病理濃度（114 μmol/L），TB的干擾濃度大于《干擾實驗指南》（WS/T 416—2013）中表C規定的建議實驗濃度（342 μmol/L）。因此，試劑盒VC抗干擾能力完全能夠滿足臨床的要求。而當樣本中TB＞368.4 μmol/L時，對尿酸的測定結果與對照比較相對偏差會超出士10%的范圍，說明尿酸測定試劑盒對膽紅素的抗干擾能力存在一定的局限。因此，為了保證數據結果準確真實，在該項目測定之前應對黃疸樣本進行鑒別，否則得到的尿酸檢測結果將不能反映樣本中真實水平。

維生素C是一種機體運行必需的維生素，具有較強的抗氧化性，能夠通過減少氧化中間產物的產生及減少炎癥反應的發生作用機制減少尿酸的合成，從而對機體血清尿酸產生影響。Vc會對尿酸測定中產生的最終產物苯醌亞胺和中間產物過氧化氫（H2O2）進行還原，從而影響尿酸水平，對最終的測定結果產生影響[6]。

膽紅素對尿酸測定的干擾分為光譜干擾和化學干擾，光譜干擾主要是由于膽紅素被主反應中間產物過氧化氫（H2O2）氧化，在400～540 nm波長吸光度的下降可掩蓋主反應吸光度的增高；而化學干擾主要是由于高濃度膽紅素破壞了Trinder的中間反應，導致有色終反應產物減少而使測定結果偏低[7]。

當發現尿酸測定結果受到維生素C和膽紅素的濃度干擾影響時，要分析原因，找到解決辦法，可采取稀釋樣本的辦法減少干擾，也可進一步嘗試加入抗干擾物質，研究開發抗干擾能力更強的尿酸試劑。