使用凍融單一病毒收獲液凍干乙腦減毒活疫苗成品質量考察

周衛，郭紅，王玖強，廖海棠，楊文杰，李俊明，周超，廖健，劉少祥

（成都生物制品研究所有限責任公司，四川省疫苗工程技術研究中心，四川成都 610023）

流行性乙型腦炎簡稱乙腦，又稱為日本腦炎（Japanese encephalitis，JE），是由嗜神經性病毒乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的中樞神經系統急性炎癥[1]。我國每年約6.8萬乙腦臨床病例，病死率可高達30%，另外高達50%的乙腦幸存者遺留嚴重的神經系統后遺癥[1-3]。目前依然沒有治愈乙腦的特效療法[4]，疫苗接種仍是預防乙腦最經濟、最有效的手段[5]。

乙腦病毒有5種基因型，分別為G1、G2、G3、G4及G5[1]。疫苗株SA14-14-2在我國廣泛使用，并認為對所有基因型均具有較好的保護效果[6-7]。乙型腦炎減毒活疫苗（乙腦活疫苗）是將SA14-14-2乙腦減毒株接種原代SPF地鼠腎細胞，收獲病毒液，加入適宜的保護劑，經分裝、凍干制成[8]。

有資料表明，乙腦活疫苗的免疫力與病毒滴度高低成正比[9]。目前，成都生物制品研究所有限責任公司（以下簡稱公司）單一病毒收獲液暫存于2～8 ℃冷庫，長期儲存病毒滴度會逐漸下降[10]。因此滴度結果出來后，需要盡快將單一病毒收獲液投入生產使用（單一效期不超過15 d），無法等所有檢定結果，從而導致中間品的風險放行。因此，研究將單一病毒收獲液-70 ℃凍存，以控制效價損失；待獲得單一病毒收獲液所有檢定結果后，再27 ℃水浴解凍；使用凍融單一病毒收獲液凍干成品，統計分析成品的相關質量屬性是否會受到影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腦活疫苗單一病毒收獲液，公司病毒性疫苗一室提供。

糖溶液、明膠溶液、原倍無酚紅歐式平衡鹽溶液、HCl溶液和20%尿素溶液，公司病毒性疫苗一室提供；人血白蛋白，成都蓉生藥業有限責任公司；BHK21細胞、MEM培養液、甲基纖維素覆蓋物和質量分數為5%的結晶紫染色液，公司質量檢定室。

1.2 儀器與設備

S220型pH計，梅特勒-托利多公司；OM819C型冰點滲透壓儀，德國羅澤公司；FLC3120型分裝機，德國博世公司；LYO-20型凍干機，上海東富龍科技股份有限公司。

1.3 凍干成品及樣品采集

將單一病毒收獲液凍存于-70 ℃冰柜，至少儲存30 d后，于27 ℃水浴融解。按照公司常規生產方法，使用凍融單一病毒收獲液配制半成品，并分裝、凍干制得成品，1人份成品批號分別為T-A001～T-A006，5人份成品批號分別為T-C001～T-C006。所有成品進行病毒基礎滴度、病毒熱穩定性、水分、pH值及滲透壓摩爾濃度等項目的檢測。

1.4 病毒基礎滴度檢測

采用《中華人民共和國藥典》（2015版）規定的BHK21細胞蝕斑法[11]122-126檢測病毒滴度，將待檢測液進行10倍系列稀釋，至少取3個稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細胞，用蝕斑法進行滴定。

1.5 病毒熱穩定性檢測

將樣品于37 ℃放置7 d后和病毒基礎滴度樣品一起進行病毒滴度檢測。

1.6 水分檢測

采用《中華人民共和國藥典》（2015版）規定的費休氏法[11]通則65，根據碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中與水定量反應的原理測定水分。

1.7 pH值檢測

采用《中華人民共和國藥典》（2015版）規定的pH值測定法[11]通則35，使用酸度計進行pH值測定，水溶液的pH通常以玻璃電極為指示電極、飽和甘汞電極和銀-氯化銀電極為參比電極進行測定。

1.8 滲透壓摩爾濃度檢測

采用《中華人民共和國藥典》（2015版）規定的滲透壓摩爾濃度測定法[11]通則36，通常采用測量溶液的冰點下降來間接測定其滲透壓摩爾濃度。

1.9 數據統計與分析

使用SPSS 24.0軟件處理數據，以常規生產均值為假設中位數和檢驗值，對檢測結果進行單樣本Wilcoxon符號秩檢驗和單樣本T檢驗：P＜0.05為差異有統計學意義，P＞0.05為差異無統計學意義。

2 結果與分析

2.1 成品病毒基礎滴度、熱穩定性檢定結果分析

2.1.1 1 人份成品

以公司成品滴度歷史數據均值6.89 lgPFU/mL為假設中位數，對6批成品滴度進行檢驗，P=0.463，P＞0.05，表明6批成品滴度與常規生產成品滴度均值差異無統計學意義；以成品熱穩定性均值6.55 lgPFU/mL為假設中位數，對6批成品熱穩定性進行檢驗，P=0.400＞0.05，表明6批成品熱穩定性與常規生產成品熱穩定性均值差異無統計學意義；以公司成品滴度下降歷史數據均值0.34 lgPFU/mL為檢驗值，對6批成品滴度下降值進行檢驗，t=0.246，P=0.815＞0.05，表明6批成品滴度下降值與常規生產成品滴度下降均值差異無統計學意義。

2.1.2 5 人份成品

以成品滴度均值6.45 lgPFU/mL為假設中位數，對6批成品滴度進行檢驗，P=0.753，P＞0.05，表明6批成品滴度與常規生產成品滴度均值差異無統計學意義；以成品熱穩定性均值6.19 lgPFU/mL為假設中位數，對6批成品熱穩定性進行檢驗，P=0.916，P＞0.05，表明6批成品熱穩定性與常規生產成品熱穩定性均值差異無統計學意義；以成品滴度下降均值0.26 lgPFU/mL為檢驗值，對6批成品滴度下降值進行檢驗，t=0.937，P=0.392＞0.05，表明6批成品滴度下降值與常規生產成品滴度下降均值差異無統計學意義。成品病毒基礎滴度、熱穩定性檢定結果見表1。對公司成品基礎滴度和熱穩定性及滴度下降值歷史數據，使用SPSS 24.0軟件進行正態性檢驗可知，常規生產中，成品基礎滴度和熱穩定性數據不服從正態分布，滴度下降值服從正態分布。

表1 成品病毒滴度、熱穩定性結果

2.2 成品水分、pH值、滲透壓摩爾濃度檢定結果分析

2.2.1 1 人份成品

以公司成品水分歷史數據均值1.07%為檢驗值，對6批成品水分進行檢驗，t=0.462，P=0.664（P＞0.05），表明6批成品水分值與常規生產水分均值差異無統計學意義；以成品pH=8.29為檢驗值，對6批成品pH值進行檢驗，t=-1.030，P=0.350（P＞0.05），表明6批成品pH值與常規生產pH均值差異無統計學意義；以成品滲透壓摩爾濃度均值734 mOsm/L為檢驗值，對6批成品滲透壓摩爾濃度進行檢驗，t=-1.496，P=0.195（P＞0.05），表明6批成品滲透壓摩爾濃度與常規生產滲透壓摩爾濃度均值差異無統計學意義。

2.2.2 5 人份成品

以公司成品水分歷史數據均值1.08%為檢驗值，對6批成品水分進行檢驗，t=1.599，P=0.171（P＞0.05），表明6批成品水分值與常規生產水分均值差異無統計學意義；以成品pH=7.96為檢驗值，對6批成品pH值進行檢驗，t=0.750，P=0.487（P＞0.05），表明6批成品pH值與常規生產pH均值差異無統計學意義；以成品滲透壓摩爾濃度均值470 mOsm/L為檢驗值，對6批成品滲透壓摩爾濃度進行檢驗，t=-0.369，P=0.727（P＞0.05），表明6批成品滲透壓摩爾濃度與常規生產滲透壓摩爾濃度均值差異無統計學意義。成品水分、pH值、滲透壓摩爾濃度檢定結果，此三項檢定結果服從正態分布，見表2。

表2 成品水分、pH值、滲透壓摩爾濃度結果

3 結論

與公司常規生產工藝相比，凍融生產工藝的優勢在于單一病毒收獲液凍存在-70 ℃條件下可長期儲存，等所有檢定項目結束后，再投入下一步使用。該工藝在顯著延長儲存時間的同時，病毒效價損失也顯著減少，且無需進行中間品的風險放行，生產安排更加靈活、可控，大大降低了因生產計劃變動而導致的單一病毒收獲液廢棄的風險。凍存需使用一次性儲液袋和超低溫設備，這在存儲材料和設備方面增加了成本，但是凍存后延長的的存儲時間，可以減少浪費以及生產廢棄所需要投入的人力、物力、財力成本，綜合評估，凍存的方式更有利于公司多方利益。

本文分析數據時使用的參考數據為乙腦減毒活疫苗常規均值，雖然數據差異無統計學意義，但由于試驗數據樣本量的限制，科室若使用凍融工藝進行生產后，仍需重新收集成品的質量屬性數據，并重新制定平均值、警戒限及行動限。

從成本和適用性出發，本試驗僅對可能受到凍融工藝影響的部分中間產品、成品質量屬性進行了考察，已考察的質量屬性數據穩定，表明凍融工藝未影響成品質量。本研究為在生產中使用凍融單一凍干成品提供了試驗基礎，今后還需對成品所有質量屬性，尤其是安全性、長期穩定性等方面進行考察，以確定在常規生產中使用凍融單一病毒收獲液凍干成品的可行性。