濾膜法和Pseudalert酶底物法檢測飲用水中銅綠假單胞菌的比較

王莉莉

（廣西綠城水務股份有限公司，廣西南寧 530031）

銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌，是一種重要的水源和食源性條件致病菌，其分布廣泛，對消毒劑、紫外線等具有一定的耐受性且對不良環境抵抗力強，在常溫的水中可以存活數月。易感人群感染后，可能引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病，因此準確檢測水中銅綠假單胞菌的情況尤為重要[1-2]。目前，銅綠假單胞菌國內標準檢測方法為《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）[3]。該方法為濾膜法，檢測時間需要48 h，并且需要后續的確證實驗，實驗耗時長，過程煩瑣。而國際上，Pseudalert酶底物法檢測瓶裝水中銅綠假單胞菌已通過ISO國際標準的認證——《水質銅綠假單胞菌的檢測和計數—最大可能數法》（ISO 16266-2：2018）[4]，可以在24 h內定量或定性檢測水中銅綠假單胞菌，無需確認實驗。本文利用傳統濾膜法和酶底物法，同時檢測定量質控、實際水樣及水樣加標中銅綠假單胞菌，對檢測結果進行了分析比較，以期對酶底物法檢測水中銅綠假單胞菌的性能進行評價，為飲用水的安全供應提供更便捷的檢測支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

4株銅綠假單胞菌（ATCC9027、ATCC27853、CMCC10104和CMCC15442）及4種陰性菌（熒光假單胞菌AS1.55、惡臭假單胞菌ATCC49128、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌）標準菌株，上海魯微科技有限公司；CN瓊脂培養基、乙酰胺肉湯、金氏B培養基等濾膜法材料，廣東環凱有限公司；Pseudalert酶底物試劑、無菌取樣瓶、97孔定量盤、NSI定量質控菌株（產品批號為020419）等耗材，IDEXX公司。

DHP-9082電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司，溫控精度為±0.5 ℃，經計量部門校準合格。

1.2 實驗方法

1.2.1 水樣采集

水樣類型包括南寧市居民的龍頭水和管網監測點的管網水。參照《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存》（GB/T 5750.2—2006）[5]進行采集和樣品保存，采樣容器使用一次性無菌含硫代硫酸鈉采樣瓶。水樣采集后冷藏保存，并在4 h內進行檢測。

1.2.2 定量質控檢測

NSI定量質控菌株從-10 ℃冰箱取出，平衡溫度10～15 min后，將質控菌株轉移入預先準備好的100 mL無菌磷酸緩沖液中，輕輕振蕩，待全部溶解后在30 min內進行檢測。

1.2.3 樣品檢測

樣品使用濾膜法和酶底物法進行檢測，濾膜法檢測步驟參照《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016），培養溫度（36±1）℃，48 h，并根據菌落顏色和熒光產生情況進行后續的確認實驗。Pseudalert酶底物法檢測步驟參照《水質銅綠假單胞菌的檢測和計數—最大可能數法》（ISO 16266-2：2018），用IDEXX取樣瓶取樣，使用定性方法檢測，培養溫度為（38±0.5）℃，24 h。

1.2.4 水樣加標

采用標準菌株，根據梯度稀釋，制作水樣加標。

1.2.5 菌落總數檢測

采用《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB/T 5750.12—2006）[6]中的方法對各個水樣品中異養菌進行菌落總數的計數。

2 結果與分析

2.1 銅綠假單胞菌定量質控檢測

濾膜法和Pseudalert酶底物法對于銅綠假單胞菌定量質控檢測結果如表1所示，結果表明：兩種方法的檢測結果均在質控樣結果的真值范圍內，Pseudalert酶底物法可以準確檢測銅綠假單胞菌定量質控。

表1 兩種方法檢測NSI定量質控樣品的結果

2.2 實際水樣和加標水樣

2.2.1 對于龍頭水和管網水的檢測

按照標準采用濾膜法和Pseudalert酶底物法對50組龍頭水和管網水進行檢測，檢測結果均為陰性。

2.2.2 對于加標水樣的檢測

濾膜法和Pseudalert酶底物法對于加標水樣的檢測結果如表2所示，水樣中的菌落總數結果如表3所示。結果表明，濾膜法和Pseudalert酶底物法對于加標水樣的檢測結果一致，Pseudalert酶底物法可以定性檢測低濃度至1 MPN/250 mL，檢測陽性水樣準確。

表3 菌落總數的檢測結果（單位：CFU/mL）

2.3 陰性菌檢測結果

Pseudalert試劑檢測4種陰性菌加標水樣均為陰性，同時檢測的菌落總數可以反映抑制濃度，結果見表4。結果表明，Pseudalert酶底物法能有效抑制陰性菌，減少假陽性結果的出現。

表4 陰性菌的檢測結果（單位：CFU/mL）

3 結論

傳統濾膜法和Pseudalert酶底物法對于水中銅綠假單胞菌的檢測結果一致，傳統濾膜法是國家標準法，在全國范圍內使用相對廣泛，需要多種培養基，配備無菌室，檢測時間長，并且需要確證實驗。Pseudalert酶底物法可以在24 h內定量或定性檢測水中銅綠假單胞菌，相對于濾膜法，檢測成本提高，但優勢明顯：無需確認實驗，操作簡單；對檢測人員的技術及經驗要求不高，可以減少人員之間的誤差及實驗室工作量；定性檢測無需設備，適合野外及應急檢測，為飲用水的安全供應提供更便捷的保證。