超聲和剪切聯合超臨界CO2法制備姜黃素脂質體

駱靚蕓

（1.阿澤雷斯國際貿易有限公司，上海 201900；2.上海交通大學 化學化工學院，上海 201100）

近年來，姜黃素儼然已成為天然藥物研究熱點之一，其具有治療炎癥、緩解關節疼痛、降低高血壓、抑制腫瘤細胞增殖等藥理活性[1]。但是姜黃素本身水溶性差，光照下易分解，在中性或堿性條件下易降解，在人體中容易被快速代謝而失去活性，導致其生物利用度極低[2]。針對其應用局限性，學者們研究了各種姜黃素劑型，如乳液、納米顆粒、脂質體等。其中，脂質體具有獨特優勢：（1）解決了水溶性差和穩定性差等問題；（2）對人體安全無毒，具有生物降解性；（3）具有更好的生物相容性，可以提高姜黃素細胞滲透率；（4）容易在肝臟等部位富集，具有靶向富集效果[3]。超臨界CO2法是一種新型綠色制備脂質體的方法，與傳統制備方法相比，其具有工藝簡單、條件可控、無溶劑殘留等優勢[4-7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

乙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；姜黃素，95%，河南晨光科技有限公司；大豆磷脂，98%，北京美亞斯磷脂技術有限公司；膽固醇，95%，阿達瑪斯試劑（上海）有限公司。

765PC紫外分光光度計，上海光譜儀器廠；SY1200超聲振蕩儀，上海聲源超聲波儀器；JEM-2100透射式電子顯微鏡，日本電子株式會社；ZS90納米粒度分析儀，英國馬爾文儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素標準曲線

將姜黃素稀釋配制得到2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L和10 mg/L姜黃素梯度溶液，以425 nm處吸光度（A）對姜黃素濃度（W）進行線性回歸，獲得姜黃素標準曲線：A=0.114 2W+0.061 8，R2=0.998 9。

1.2.2 姜黃素脂質體制備條件優化

1.2.2.1 制備流程

姜黃、大豆磷脂和膽固醇在研缽中研磨成餅狀，分次加入30 mL的PBS磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=6.0），繼續研磨至均勻后加入高壓釜。在剪切、45 ℃條件下，通入超臨界CO2直至設定壓力后開啟超聲，保持超聲和剪切共同處理40 min。依次停止加熱、剪切和超聲，釋放CO2。加入100 mL的PBS磷酸緩沖溶液沖洗釜內壁上的黃色顆粒，超聲和攪拌共同處理40 min，即得姜黃素脂質體溶液。

1.2.2.2 剪切速度優化

壓力20 MPa，溫度45 ℃，大豆磷脂占總脂質（磷脂和膽固醇總和）質量的83%，姜黃素占總脂質質量的5%，超聲功率45 W，超聲和剪切處理40 min，剪切速度分別設置為1 000 r/min、3 000 r/min、5 000 r/min和 7 000 r/min。

1.2.2.3 超聲功率優化

壓力20 MPa，溫度45 ℃，大豆磷脂占總脂質質量的83%，姜黃素占總脂質質量的5%，剪切速度5 000 r/min，超聲和剪切處理40 min，超聲功率分別設置為0.0 W、22.5 W、45.0 W和180.0 W。

1.2.2.4 大豆磷脂添加量優化

壓力20 MPa，溫度45 ℃，姜黃素占總脂質質量的5%，剪切速度5 000 r/min，超聲功率45 W，超聲和剪切處理40 min，磷脂質量分別為總脂質的50%、67%、83%和100%。

1.2.2.5 姜黃素添加量優化

壓力20 MPa，溫度45 ℃，磷脂添加量占總脂質的83%，剪切速度5 000 r/min，超聲功率45 W，超聲和剪切處理40 min，姜黃素質量分別為總脂質的3%、5%、8%和10%。

1.2.3 姜黃素脂質體包封率的測定

將姜黃素脂質體溶液混合均勻后在425 nm處測量吸光度 A1，計算Wz；溶液離心（5 000 r/min，15 min）后取上清液測量吸光度A2，計算W1。包封率（EE）的計算公式如（1）所示：

1.2.4 姜黃素脂質體粒徑分布

姜黃素脂質體溶液用去離子水稀釋50倍至清澈透明狀態，在馬爾文粒度儀上測量姜黃素脂質體粒徑和粒徑分布。

1.2.5 姜黃素脂質體形貌表征

姜黃素脂質體溶液離心（5 000 r/min，15 min）后取上清液，用4 μm濾膜過濾后滴在300目覆有碳膜的銅網上，待樣品完全干燥，觀察姜黃素脂質體微觀結構。

1.2.6 姜黃素脂質體體外釋放分析

PBS緩沖溶液（pH=7）和乙醇以1∶25的體積比混合作為釋放介質，稱取姜黃素溶解于釋放介質制成和姜黃素脂質體相同濃度的溶液，將姜黃素脂質體和姜黃素溶液放入已經預處理過的孔徑0.001 μm濾袋中，夾緊開口后浸入100 mL的釋放介質中，（37±0.5）℃水浴攪拌，分別于 0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、12.0 h和24.0 h取5 mL樣品，取樣后立即補充5 mL空白釋放介質。分別測量各個樣品425 nm下的吸光度，計算其累積釋放率[3]。

2 結果與分析

2.1 制備工藝優化

由于姜黃素水溶性極差，通過濕法研磨前處理可以使磷脂分子包裹姜黃素均勻混合。采用高速剪切設備來破壞超臨界CO2和水相之間的界面張力以及水膨脹的大豆磷脂凝聚，磷脂分子在剪切應力作用下形成球形膠束，釋放CO2后形成球形雙層分子層囊泡，將表面張力降低至零。超聲和剪切聯合作用會使得脂質體顆粒更小，分布更均勻，所以超聲和剪切作用是該方法的關鍵[4]。

2.1.1 剪切速度

如圖1所示，隨著剪切速度的提高，姜黃素脂質體包封率顯著升高后變化平緩，粒徑減小。當轉速達到5 000 r/min時，包封率達到最大，為87.45%±0.30%；粒徑為323.00 nm±2.86 nm。因此，選擇5 000 r/min作為最佳的剪切速度參數。

圖1 剪切速度對姜黃素脂質體的影響

2.1.2 超聲功率

如圖2所示，隨著超聲功率的增加，姜黃素脂質體包封率顯著升高，達到最大值后略有下降；粒徑則先減小后增加。當超聲功率為45 W時，包封率最高，為87.11%±0.21%，此時粒徑為321.50 nm±13.40 nm。過度超聲會引起脂質體融合，導致脂質體泄漏，粒徑變大，分布不均勻[8]。因此，以45 W作為最佳超聲功率。

圖2 超聲功率對姜黃素脂質體的影響

2.1.3 大豆磷脂添加量

如圖3所示，隨著大豆磷脂添加量變大，姜黃素脂質體包封率先升高后降低，粒徑則持續減小。當大豆磷脂添加量為83%時，包封率最大，為78.82%±0.47%；當大豆磷脂添加量為100%時，脂質體粒徑最小，為165.93 nm±7.98 nm。通常情況下，適量膽固醇的加入可以提高脂質膜的流動性，比單一大豆磷脂組成的雙分子層膜穩定性更好[9]。因此，綜合考慮以83%作為大豆磷脂的添加量。

圖3 大豆磷脂添加量對姜黃素脂質體的影響

2.1.4 姜黃素添加量

如圖4所示，隨著姜黃素添加量升高，姜黃素脂質體包封率逐漸下降，粒徑持續變大。姜黃素含量為3%時，包封率最大，為94.23%±0.22%；粒徑最小，為171.13 nm±13.60 nm。研究證實，姜黃素引入脂質雙分子層結構中會導致結構松弛，使得脂質體穩定性變差，脂質體顆粒尺寸增大[10]。因此，綜合考慮以5%作為姜黃素的最佳添加量。

2.2 姜黃脂質體微觀形貌

如圖5所示，由超聲和剪切聯合超臨界CO2法制備得到分布均勻的球形小囊泡，粒徑為200 nm左右，外膜平滑顏色較深，中間內核透明，符合脂質體結構特征。

2.3 姜黃素脂質體釋放動力學

如圖6所示，姜黃素在24 h后累計釋放了5.5%，姜黃素脂質體在24 h內持續釋放，共釋放了53.50%姜黃素，說明姜黃素脂質體在體外具有緩慢釋放、提高溶解度的特點。

圖6 姜黃素和姜黃素脂質體體外釋放曲線

3 結論

本研究中建立了一種新的姜黃素脂質體制備方法，使用超臨界CO2代替有機溶劑制備得到包封率較高的姜黃素脂質體，具有操作簡單、無溶劑殘留、包封率高、粒徑均勻等優點，且制備得到的姜黃素脂質體體外釋放率是姜黃素的10倍。其中，剪切速度和超聲強度對產品影響最大，隨著剪切速度的增大和超聲強度增強，姜黃素脂質體包封率顯著增大，顆粒尺寸明顯變小；但剪切速度過大或超聲強度過強會導致姜黃素脂質體破裂，影響產品質量。