鐵皮石斛浸膏中有機溶劑殘留的方法學研究

夏正晴，謝恩耀

（鑒甄檢測技術（上海）有限公司，上海 200137）

鐵皮石斛（Dendrobium of ficinale）在中藥學中有著舉足輕重的科研價值，眾多研究表明，其含有豐富的無機礦物元素、氨基酸、固醇及脂肪酸等物質，具有極高的藥用價值[1-3]。自20世紀七八十年代起，便拉開了對鐵皮石斛的研究序幕，鐵皮石斛的繁育及質控體系相較于其他中藥材也已相對成熟[1,4-6]。

全浸膏作為多種中藥制劑生產工藝中主體物料半浸膏的前體原料，其主要工藝流程便是通過水或有機溶劑（如食用乙醇等）將中藥有效成分浸出，并通過濃縮工藝加工形成的一種膏狀黏稠物，因同時采用水提及有機試劑提取工藝，原中藥植株中大量的水溶性及脂溶性有效成分得到了極大的保留，從而得到了廣泛的認可[7-9]，而目前眾多針對中藥材或是制劑的研究中卻鮮有人針對全浸膏類進行質控。

隨著人們生活質量的逐步提高，人們對自身保健及疾病醫療方面的需求也得到了極大的發展，對中藥的需求逐漸增加。現代社會生活節奏的不斷加快使得中藥飲片煎服障礙重重，因此更加高效的中藥丸劑、片劑、膠囊乃至于膏劑便在如今的市場中受到熱捧，但與需求極為不匹配的公眾中藥鑒別能力問題亦日漸突出。本文以當前研究較為完善的鐵皮石斛為研究對象，參照《食品工業用吸附樹脂產品測定方法》（GB 24396—2009）中對有機溶劑殘留的檢測方法，對鐵皮石斛全浸膏中有機溶劑殘留進行方法學開發[10]，從而為完善中藥質控體系提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛全浸膏，實驗室自制，陰涼柜保存。

甲醇（MeOH）、二甲基亞砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF），色譜級，德國CNW公司；苯、乙醇、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲苯、氯苯、苯乙烯，純度≥99.5%，阿拉丁化學試劑公司；1,2-二氯乙烷、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯，純度≥99.5%，壇墨質檢標準物質中心；超純水，默克密理博超純水系統制取，現取現用。

1.2 儀器設備

7697A-7890B頂空氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；HS20-TQ8050氣質聯用儀，島津企業管理（中國）有限公司；XS105DU電子天平，梅特勒國際貿易（上海）有限公司；Multipette E3x電子分液器，德國艾本德股份有限公司；JP-080S超聲波清洗機，深圳潔盟設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 稀釋液配制

取純水245 mL置于500 mL試劑瓶中，再向其中加入DMSO試劑250 mL，最后加入DMF試劑5 mL，混勻后置于冰水浴中冷卻后制得。

1.3.2 標準品溶液配制

將1.1中所示標準品（除乙醇外）用MeOH分別配制成濃度約為5 mg/mL的標準品儲備液，再移取各標準品儲備液120.0 μL用MeOH定容至10.00 mL，得到約60 μg/mL的溶劑殘留混標溶液，記為MMS。

1.3.3 標準曲線溶液配制

依次吸取MMS溶液30.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、150.0 μL及200.0 μL置于10 mL容量瓶中用稀釋劑稀釋定容后備用，分別記為L1（即定量限LOQ）、L2、L3、L4、L5。

1.3.4 檢測限溶液配制（LOD）

吸取MMS溶液15.0 μL置于10 mL容量瓶中用稀釋劑稀釋定容后備用。

1.3.5 供試品溶液配制

稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密加入稀釋劑溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min即得。

1.3.6 準確度溶液配制（即ACC溶液）

ACC-L溶液（30%添加水平）：稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密移取標曲L1溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min后進樣分析。

ACC-M溶液（100%添加水平）：稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密移取標曲L3溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min后進樣分析。

ACC-H溶液（150%添加水平）：稱取供試品約100 mg，置20 mL頂空瓶中，精密移取標曲L4溶液1 mL，壓蓋密封，超聲15 min后進樣分析。

為保證實驗準確性，以上準確度溶液每個進樣不少于3次。

1.3.7 重復性溶液配制

配制方法同1.3.6中ACC-M溶液，重復進樣不少于6次。

1.3.8 耐用性溶液配制

配制方法同1.3.6中ACC-M溶液，共配制14組，初始條件進樣2次，每個波動條件各進樣2次，儀器波動條件依據為進樣口溫度±2 ℃，色譜柱初始溫度±2 ℃，色譜柱流速±0.02 mL/min。

1.4 儀器參數

1.4.1 氣相色譜參數

色 譜 柱 型 號 為 CD-WAX（30 m×320 μm×0.5 μm），分流比6∶1，恒流流速1.0 mL/min，升溫程序：40 ℃（6 min），10 ℃/min升溫至150 ℃，以25 ℃/min升溫至220 ℃（2 min），氫火焰檢測器（FID），檢測器溫度250 ℃。

1.4.2 頂空參數

頂空爐溫80 ℃，定量環溫度90 ℃，傳輸線溫度220 ℃，頂空平衡時間45 min，定量管填充時間0.3 min。

2 結果與分析

2.1 標準曲線與LOD/LOQ

標準曲線和LOD/LOQ實驗結果如表1、表2所示，受檢的總計10種常見的有機溶劑其LOD信噪比均大于3，總體呈現較為完好的結果，而LOQ的信噪比也均超過了10，綜合各個目標物的線性回歸系數R2結果均高于0.995來看，其在180～1 200 ng/mL的濃度區間內均呈現出良好的線性，表明此檢測過程中的儀器參數符合實驗要求。

表1 標準曲線結果

表2 LOD/LOQ信噪比結果

2.2 準確度

準確度實驗過程中會產生基質干擾效應，從而導致樣品加標的回收率結果出現浮動，無法滿足方法學的驗證要求[11]。實驗過程中發現由于DMSO的強抓取性質，通過提高其在稀釋劑中的比例能夠有效降低目標物的揮發水平，當采用純DMSO作為稀釋劑時，部分目標物在FID上的響應接近于0。且全浸膏中含有較多的揮發油成分，過高的頂空平衡溫度會致使供試品中的揮發油進入檢測器，從而產生較大的基質干擾，對實驗結果造成不可預估的影響。因此本研究通過改變稀釋劑中DMSO和水的比例、控制頂空OVEN的溫度及平衡時間，最終將溶劑的揮發度保持在較為合理的范圍。

從表3可知，10種溶劑殘留的加標回收率最高為116%，分別出現在間二甲苯、氯苯和苯乙烯的低濃度加標結果中，最低為丙烯酸甲酯的98%，總體回收率均處于2020年版《中國藥典》要求的80%～120%，符合方法學驗證的要求[12]。

表3 加標回收結果

2.3 重復性

重復性實驗采用的是100%濃度加標樣品，重復進樣6次，在判定儀器系統穩定性的同時亦對前處理方法的穩定及可靠性進行了考察，其最終結果如表4所示，10個目標物重復性RSD在0.0%～3.7%，符合2020年版《中國藥典》規定中＜8%的要求[12]。

表4 重復性結果

2.4 方法耐用性

各耐用性條件下，同一參數波動中，6份100%濃度加標準確度溶液中各種目標物峰面積的RSD均在0.0%～8.3%范圍內波動，滿足2020年版《中國藥典》中耐用性RSD＜15%的要求[12]，因此該方法耐用性良好（表5、表6、表7）。

表5 起始柱溫度因素耐用性（峰面積值）

表6 進樣口溫度因素耐用性（峰面積值）

表7 流速因素耐用性（峰面積值）

2.5 苯疑似物檢測結果

針對重復性和標準曲線L3中峰面積響應結果差異性問題，筆者進行了問題排查，最終發現是由于頂空進樣器盤位有限，因此將準確度、耐用性編為一組序列（1號序列），而將重復性單獨編組了序列（2號序列），本文線性數據采集自1號序列組所產生的數據，因此與2號序列組的數據產生了細微偏差。

進一步對圖1準確度譜圖分析不難發現，在溶劑苯的出峰位置存在著一個極大的干擾峰，導致與標準物質譜圖中苯的保留時間有所偏移，但總體依舊處于目標物苯的出峰時間范圍內，正因如此，造成了兩組不同序列苯的峰面積差異，為了解決這一問題，后續采用島津GC-MS對此物質進行分析研究。

圖1 供試品譜圖

在相同保留時間，供試品及標準品均有出峰，出峰物質經NIST譜庫檢索可知其分別是苯和乙醇（圖2、圖3），后續加標色譜圖如圖4所示，其中圓圈標注部分可以發現乙醇峰及苯峰的峰頂點位置幾乎重疊，因此判定在FID檢測器上乙醇峰對有機溶劑苯的定量產生了少許干擾，在后續進行全浸膏類物質質量控制過程中，苯的溶劑殘留控制使用質譜進行檢測會更加的可靠。

圖2 標準品質譜圖

圖3 供試品質譜圖

圖4 供試品及加標TIC圖

3 結論

本文對中藥材鐵皮石斛全浸膏進行了有機溶劑殘留質控方法的開發工作，亦是目前首次針對全浸膏類產品的質控研究，填補了這一領域的空白，為高速發展的中藥保健品及制劑市場提供一種質量溯蹤的依據。

對鐵皮石斛全浸膏進行有機溶劑殘留檢測的方法學開發，結果表明目標物在180～1 200 ng/mL的濃度區間內有良好的線性關系，準確度、重復性及方法耐用性均符合藥典要求，此方法完全滿足鐵皮石斛浸膏的質控需求。

針對目標物苯的出峰時間處存在干擾，采用GC-MS的方法進行定性，從而確定此處干擾是乙醇造成。由于全浸膏的制作工藝過程中常用水提醇沉法進行提取，或使用乙醇進行脂溶性營養成分的浸提，不可避免的會帶來乙醇的干擾，研究結果表明全浸膏類產品溶劑殘留質控時應盡可能采用質譜法，以減少類似的干擾。