cTnI-C質控物制備與評價

盧艷華，周志偉，陳小燕，盧航，王小明

（廣州天寶頌原生物科技開發有限公司，廣東廣州 510663）

作為心肌損傷標志物，心肌肌鈣蛋白I（cTnI）在臨床應用已超過20年，隨著技術的發展，cTnI檢測方法的檢出能力大大提升，已發展為高敏cTnI（hs-cTnI）檢測方法。文獻顯示，hs-cTnI-VITROS用于急性心肌梗死診斷的AUC為0.95（95%CI，0.93～ 0.96），臨 床 敏 感 性 達 到 100%（95%CI，94.1～ 100），臨 床 特 異 性 達 到 95.6%（95%CI，93.4～97.2）[1]。hs-cTnI已成為急性心肌梗死分型的關鍵判定指標[2]，并為非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征（NSTE-ACS）患者的診斷、風險分層和治療方面提供了必要的補充[3]。cTnI應用廣泛，市場產品種類眾多，國家藥品監督管理局的數據顯示，cTnI檢測產品超過96種，方法學原理超過13種。由于產品的方法學原理和抗體對的多樣性，及cTnI分析物異質化，cTnI檢測方法的標準化是個難點，單獨使用天然心肌肌鈣蛋白I或重組心肌肌鈣蛋白復合物（cTnI-C）制備的參考物質作為校準物無法改善檢測方法的差異，而采用混合臨床樣本作為校準物可將檢測方法的變異系數（CV）從88%降至15.5%[4]。

混合臨床樣本可作為二級參考物質實現全球檢測系統的一致化，但由于其存在臨床樣本資源有限、生物安全性不確定及易降解等問題，不適合用作終端用戶cTnI檢測系統的校準和質量控制。開發穩定、安全、充足的cTnI校準物和質控物，不僅可以用于將二級參考物質的準確性通過溯源途徑傳遞至臨床樣本，保證檢測系統具有跨時空的可比性，還能用于室內質量控制，保證cTnI檢測系統的穩定性，提高臨床檢測質量。天然cTnI的N末端和C末端非常不穩定易發生降解，但其30～110氨基酸區域穩定，該區域因與心肌肌鈣蛋白C（cTnC）結合緊密而受到保護。天然cTnI樣本穩定性不佳，采血到分析檢測的時間要控制在4 h以內[5]，重組穩定區域（氨基酸28～110）cTnI和全長cTnC復合物的穩定性優于全長cTnI和全長cTnC復合物，能在2～8 ℃保存4個月、-20 ℃下保存1年、37 ℃下保存3 d，但部分檢測系統無法識別[6]。

為了使校準物和質控物保存穩定時間更長，并適用于絕大部分檢測系統，本研究選擇基因工程合成的全長cTnI和全長cTnC復合物，篩選合適的基質及凍干保護劑，制備出了免疫反應性、均一性、穩定性優良的質控物，且該質控物原料和配方同樣適用于生產定值校準品，可為提高臨床實驗室cTnI檢測質量奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

胎牛血清，貨號SH30406.05，Gibco；正常人血清，貨號3SH002，Scantibodies Laboratory Inc；心肌質控品，貨號CQ3100，英國朗道實驗診斷有限公司；cTnI-C重組抗原，廣州天寶頌原生物科技開發有限公司；海藻糖，分析純，廣州化學試劑廠；甘露醇、甘氨酸，分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司。

4種cTnI檢測系統：AI8200化學發光免疫分析儀及配套cTnI試劑，廣州天寶頌原生物科技開發有限公司；Access儀器及配套cTnI試劑，美國貝克曼庫爾特有限公司；ARCHITECT i2000SR儀器及配套cTnI試劑，美國雅培公司；VIDAS儀器及配套cTnI試劑，法國生物梅里埃公司。依次編號為檢測系統A、B、C、D。

DW-86W100型超低溫冰箱，海爾集團；FD-1A-50型真空冷凍干燥機，博醫康儀器有限公司。

1.2 基質篩選

基質a：正常人血清；基質b：胎牛血清；基質c：磷酸緩沖溶液（0.05 mol/L PB、0.15 mol/L NaCl、1%BSA、0.09%NaN3，pH=7.5）；基質d：Tris緩沖溶液（0.2 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、0.3%Tween-20、2.5% 甘 油、0.5%BSA、0.09%NaN3，pH=7.4）；基質e：無緩沖體系溶液（0.15 mol/L NaCl、0.5%BSA、0.05%Tween-20、0.05%NaN3，pH=6.5）。將cTnI-C重組抗原分別使用上述基質配制成2種濃度水平的液態質控物，濃度水平1（C1）在0.1～0.3 ng/mL，濃度水平2（C2）在1～3 ng/mL，配制體積各為10 mL，使用離心管分裝成1 mL/管，每組2管分別放置于-20 ℃、2～8 ℃、25 ℃條件下儲存7 d后取出，使用cTnI檢測系統A測定，每個樣品檢測8個重復，相比-20 ℃對照條件，在2～8 ℃、25 ℃的檢測結果下降幅度最小組判定為最優基質。

1.3 凍干保護劑篩選

使用液態最穩定基質b按1.2方法配制質控物，配制體積為100 mL，質控物分裝為4組，每組25 mL，按照質量分數分別添加不同的凍干保護劑。Ⅰ組：未添加保護劑；Ⅱ組：添加3%海藻糖；Ⅲ組：添加0.5%甘露醇；Ⅳ組：添加1%甘氨酸。質控物混勻后，分裝為1 mL/管，在質控物瓶身作好組別和水平濃度的標識，然后放置于-80 ℃超低溫冰箱預凍18～24 h，預凍結束后快速轉移至已預冷的真空冷凍干燥機中干燥24 h，所有凍干品取出后立即加塞加蓋。每組取5瓶放置于37 ℃烘箱中加速7 d，取5瓶放置于37 ℃烘箱中加速14 d，剩余10瓶放置于2～8 ℃ 保存7 d，保存時間結束后取出放置于-20 ℃條件下，所有樣品在保存結束的最后一天，同一時間段，使用cTnI檢測系統A測定。取各類保存條件下的5瓶質控品進行檢測，每瓶檢測2個重復，計算10個數據的均值，統計37 ℃加速7 d和14 d組與2～8 ℃對照組檢測結果的相對偏差，下降程度最小組判定為最優保護劑。

使用上述確定的cTnI-C質控物配方和凍干工藝制備一批cTnI-C質控物，數量為200瓶，用于后續的免疫反應性、均勻性和穩定性研究。

1.4 免疫反應性

用A、B、C、D檢測系統同步評估檢測自制cTnI-C質控物及朗道心肌質控品免疫反應性。檢測之前，按照制造商要求使用配套校準物和質控物對檢測系統進行校準和質控，質控合格后檢測cTnI-C質控物和朗道心肌質控品，每個濃度水平重復3次。

1.5 均勻性評估

參照《體外診斷實際用質控物通用技術要求》（YYT 1652—2019）所述方法，檢測質控品均勻性[7]。隨機抽取10瓶質控物并編號1～10，使用cTnI檢測系統A重復檢測3次，檢測順序為1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。采用單因素方差分析方法，計算F值，若F≤F0.05（ν1，ν2）=F0.05（9，20）=2.39時，則瓶間均勻性無顯著性差異。

1.6 穩定性評估

檢測系統存在隨機誤差，并可能對環境溫度、濕度及操作敏感[8]。為使檢測結果具有可比性，穩定性評估宜采用同步設計，但實時穩定性周期較長，為有利于及時發現問題宜采用經典設計，質控物保存第0、1、2、3、4、6、9、11、12和13個月時，取出4瓶質控物進行檢測，每瓶重復檢測2次，檢測結果參照《體外診斷試劑穩定性評估指南》（EP 25-A）中“5.3數據分析”方法進行統計，將所有保存時間點的檢測結果平均值（y軸）與試驗日（x軸）進行線性回歸，對回歸系數進行t檢驗，通過P值判定回歸系數是否具有統計學顯著性，當P＞0.05時，回歸系數沒有統計學顯著性，在保存時間內試劑穩定。

2 結果與分析

2.1 基質篩選

以不同基質溶解、稀釋重組cTnI-C抗原，并采用不同溫度保存后測定效價，結果顯示其效價因基質不同存在差異。如表1所示，在2～8 ℃條件保存7 d后，稀釋液a、b、c、d和e基質配制的cTnI-C質控物效價穩定；在25 ℃條件保存7 d后，所有基質配制的cTnI-C效價均呈現不同程度的下降。其中，b基質配制的cTnI-C質控物效價下降幅度為10%～20%，c、d基質配制的cTnI-C質控物下降幅度為20%～30%，a、e基質配制下降幅度30%～40%。根據25 ℃條件下的穩定性結果可知，cTnI-C質控物對溫度敏感，液態形式無法進行常規運輸，保存期限少于1年，需要制備成凍干質控物。而b基質熱穩定性最優，意味著使用該基質制備成凍干質控物，復溶后質控物的使用穩定性可滿足臨床實驗室的校準和質控需求。

表1 不同基質cTnI-C質控物在各條件保存7 d的結果（單位：ng/mL）

2.2 保護劑篩選

如表2所示，在cTnI-C質控物中添加3%的海藻糖可提高質控物的熱穩定性，質控物37 ℃加速7 d和14 d后效價無顯著變化；添加甘氨酸有一定程度改善作用，但是改善不明顯；而添加甘露醇無改善作用。后續性能評價用cTnI-C質控物的配方采用cTnI-C重組抗原+基質b+3%海藻糖，凍干工藝為預凍18 h，凍干24 h。

表2 添加不同保護劑的cTnI-C質控物凍干品在37 ℃加速后的檢測結果（單位：ng/mL）

2.3 免疫反應性

采用市場主流檢測系統可以檢測到cTnI-C質控物，并與預期一致，呈現濃度梯度效應（見表3）。說明本研究制備的質控品可作為本公司及其他廠家校準物或質控物的原料。

表3 主流檢測系統測試cTnI-C質控物和朗道心肌質控品的結果（單位：ng/mL）

2.4 均勻性

2個濃度水平的cTnI-C質控物均勻性檢測結果均符合要求，瓶間效價無顯著性差異，瓶間CV均小于10%。見表4、表5、表6和表7。

表4 濃度水平1均勻性檢測結果（單位：ng/mL）

表5 濃度水平1均勻性檢測結果方差分析

表6 濃度水平2均勻性檢測結果（單位：ng/mL）

表7 濃度水平2均勻性檢測結果方差分析

2.5 穩定性

2個濃度水平的cTnI-C質控物在0、1、2、3、4、6、9、11、12和13個月的檢測結果線性回歸斜率的P＞0.05，沒有統計學顯著性，質控物在2～8 ℃條件下保存13個月穩定。結果見表8、表9、表10。

表8 cTnI-C質控物實時保存穩定性檢測和統計結果（單位：ng/mL）

表9 濃度水平1穩定性結果方差分析

表10 濃度水平2穩定性結果方差分析

3 結論

cTnI質控品的研制主要由試劑公司研發人員或是醫院臨床檢驗科人員開展，試劑公司研發者傾向于研究cTnI抗原的原核表達及應用[9-10]，他們對抗原表達的原料和工藝的研究詳細具體，但在質控物的性能評估方面不如臨床檢驗科人員的研究充分[11]。臨床自制的混合樣本質控品由于資源有限性而無法廣泛推廣應用，而重組抗原制備的cTnI凍干質控品以健康人血清為基質，且未添加保護劑，在真空冷凍干燥過程中，由于低溫和失水可能會使蛋白質空間結構變化，使得凍干制品穩定性變差[12]。因此，本研究基于試劑公司在原料和工藝開發上的資源，借鑒臨床實驗室在質控品的科學評價體系，研究了cTnI質控品的配方，評估了免疫反應性、均一性、穩定性。結果表明3%海藻糖可顯著改善cTnI蛋白的熱穩定性，液態質控物和未添加保護劑的質控物在37 ℃保存無法超過7 d，添加3%海藻糖的cTnI-C質控物在37 ℃條件穩定時間不少于14 d。根據類似產品的阿倫尼烏斯公式推測，cTnI-C質控物2～8 ℃保存有效期超過2年。實時穩定性結果顯示cTnI-C質控物2～8 ℃保存有效期不少于13個月。凍干保護劑常見于各類菌種、疫苗的應用，在檢驗醫學領域標準品、校準品、質控品中的應用和機理還需要深入研究，以期為生產穩定的校準和質控物奠定理論基礎。

cTnI分析物存在多種形式，通過室間質評（EQA）結果發現cTnI的檢測結果變異很大，一致性差，cTnI的穩健CV可達120%[13]。國際臨床化學聯合會（IFCC）已成立工作組致力于cTnI的一致化研究，但由于不同試劑廠家使用的cTnI抗體對不同及陽性病人血清中cTnI的復雜性的影響，cTnI一致化可能短時間內無法實現[14]。國際范圍內未實現cTnI一致化的情況下，各制造商依舊需要通過內部校準物保證各批次試劑、不同類型儀器間cTnI檢測結果的準確性，各臨床實驗室需要通過質控物保證檢測系統準確度未發生偏倚，精密度在規定范圍內。本研究的cTnI-C質控物和朗道心肌質控品均可以被主流檢測系統識別，由于抗體、方法學原理等差異，不同檢測系統檢測質控物的結果不具有一致性，使用待監控檢測系統進行賦值后可應用于臨床室內質量控制。

cTnI-C質控物是臨床室內質量控制、室間質評、產品檢驗和校準的基礎物質。隨著cTnI聯合其他心肌和心衰生物標志物在臨床上的應用越來越廣泛[15-16]，且對檢驗質量要求越來越高[17]，對cTnI-C質控物的需求會更大，質量要求也更高。本研究獲得的cTnI-C質控物配方對制造商生產的cTnI檢測系統質量和臨床實驗室終端用戶檢驗質量的提高都具有積極的意義。