石楠藤多糖的提取及其抗氧化活性研究

覃亮，劉航博，韋宇，吳貽淋，周曉橦，戴思敏

（肇慶學院 食品與制藥工程學院，廣東肇慶 526061）

石楠藤為胡椒科植物毛蒟[Piper puberulum(Benth.)Maxim.]的干燥枝葉，又名爬巖香、巴巖香等，性辛，溫，歸肝、脾經，常用于治療風寒濕痹、筋骨疼痛[1-2]。研究表明，石楠藤的化學成分主要有木脂素、新木脂素類、酰胺生物堿類、有機酸、甾醇類和揮發油等[3-4]。我國科研工作者對石楠藤含有的有效成分做了大量活性研究。許寶華等[5]發現，石楠藤提取物對急性出血性壞死性胰腺炎大鼠內毒素血癥具有較好的防治作用。陳少奇等[6]發現，石楠藤提取物使小鼠的逃避潛伏期以及尋找平臺游泳距離均出現明顯地縮短（P＜0.05），明顯提高AD模型小鼠的學習記憶能力，拮抗或修復Aβ25-35對小鼠學習能力的損傷。為拓展人們對石楠藤應用價值的認識，本試驗將優化石楠藤多糖提取工藝，并評價其抗氧化活性，為石楠藤作為藥用植物資源的進一步開發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石楠藤，廣東清源中藥飲片有限公司（批號：1952167）。

1,1-二苯基-2-苦味基肼（DPPH，C14114102）、二甲基亞砜（DMSO，C17354346），上海麥克林生化科技有限公司；石油醚、無水乙醇、葡萄糖、苯酚等，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用水為蒸餾水。

XL-30C新型高速連續式超微粉碎機，廣州市旭朗機械設備有限公司；TDL-40C低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥材的脫脂處理

石楠藤粉末以石油醚為溶劑，索式提取法脫脂，藥渣置于通風處晾干，得到脫脂石楠藤干粉，備用。

1.2.2 繪制標準曲線

吸取0.1 mg/mL葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL，到標好序號的試管中，并用膠頭滴管滴加蒸餾水到2.0 mL，使之濃度稀釋為0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL、0.030 mg/mL、0.035 mg/mL和0.040 mg/mL，往試管依次滴加1.0 mL的5%苯酚溶液，輕輕振蕩加搖動，小心準確地加入濃硫酸5.0 mL，靜置數分鐘。根據紫外分光光度法，在490 nm處記錄吸光度[7]。以葡萄糖溶液的濃度X（mg/mL）為橫坐標，以葡萄糖溶液的吸光度A為縱坐標，即得線性方程A=23.711X-0.1148，相關系數R2=0.999 7，可見在0.010～0.040 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.3 單因素試驗

（1）提取溫度對石楠藤多糖提取率的影響。采用水提醇沉法提取石楠藤多糖，具體工藝為：將脫脂石楠藤粉末50 g置于圓底燒瓶中，加入2 L蒸餾水，分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃條件下加熱攪拌提取60 min，過濾得粗多糖溶液。溶液經脫蛋白、脫色后，再次過濾，濃縮，加入無水乙醇至乙醇含量為60%，醇沉過夜，離心得粗多糖，冷凍干燥24 h，取出存好，備用。實驗重復3次，多糖得率的計算如式（1）。

式（1）中，m為多糖質量，g；M為脫脂石楠藤粉末的質量，g。

（2）提取時間對石楠藤多糖提取率的影響。參考（1）的方法，料液比1∶40（g∶mL）、提取溫度80 ℃，加熱攪拌50 min、60 min、70 min、80 min和90 min，提取液經脫蛋白、脫色、濃縮處理后，加入無水乙醇至乙醇含量為60%，醇沉得到多糖并按式（1）計算多糖得率。

（3）料液比對石楠藤多糖提取率的影響。參考（1）的方法，提取溫度80 ℃，提取時間70 min，料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60（g∶mL），提取液經脫蛋白、脫色、濃縮處理后，加入無水乙醇至乙醇含量為60%，醇沉得到多糖并按式（1）計算多糖得率。

（4）醇沉體積分數含量對石楠藤多糖提取率的影響。參考（1）的方法，料液比1∶50（g∶mL）、提取溫度80 ℃，提取時間70 min，提取液經脫蛋白、脫色、濃縮處理后，分別加入無水乙醇至乙醇含量為50%、60%、70%、80%和90%，醇沉得到多糖并按式（1）計算多糖得率。

1.2.4 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以提取溫度、提取時間、料液比和醇沉體積分數作為影響因素，設計L9（34）正交試驗（見表1），每組3個平行。

表1 正交試驗設計表

1.2.5 多糖抗氧化試驗

將2 mL的0.2 mmol/L DPPH（溶于95%乙醇中）添加到2 mL的樣品溶液中。混合均勻后在室溫下避光反應15 min，在517 nm處測量上清液的吸光度，清除率計算公式如式（2）[8]。

對照用無水乙醇代替DPPH進行，無水乙醇替代樣品作空白，維生素C用作陽性標準，每組實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

溫度對多糖提取率的影響如圖1所示，當溫度達到80 ℃時，石楠藤多糖提取率達到最高，隨后多糖的提取率開始下降，因此選擇70 ℃、80 ℃、90 ℃作進一步優化。提取時間對多糖含量的影響如圖2所示，當提取時間為60 min時，多糖提取率達到最高，隨后提取率趨于平緩并有下降趨勢，因此選擇60 min、70 min、80 min作進一步優化。料液比對多糖含量的影響如圖3所示，多糖提取率隨著料液比的增大逐漸上升，當料液比達到1∶50（g ：mL）時多糖提取率達到最高，隨后趨于平穩，因此選擇1∶40、1∶50、1∶60（g ：mL）的料液比作進一步優化。醇沉體積分數對多糖含量的影響如圖4所示，當醇沉體積分數為60%時，多糖提取率達到最高，隨后提取率趨于平緩，故選擇50%、60%、70%作進一步優化。

圖1 提取溫度對多糖含量的影響

圖2 提取時間對多糖含量的影響

圖3 料液比對多糖含量的影響

圖4 醇沉體積分數對多糖含量的影響

2.2 正交優化多糖提取工藝

從表2可知，石楠藤多糖提取各因素影響程度依次為醇沉體積分數＞提取溫度＞料液比＞提取時間，最優提取工藝為A2B2C2D3，即提取溫度為80 ℃，提取時間70 min，料液比為1∶50（g ：mL），醇沉體積分數為70%。

表2 試驗設計及結果

2.3 驗證試驗

為驗證工藝的穩定性，按照優化的工藝平行提取3次，多糖提取率分別為5.38%、5.40%、5.36%，工藝穩定性良好。

2.4 多糖抗氧化試驗

試驗結果表明（圖5），當多糖質量濃度為0.2～5.0 mg/mL時，石楠藤多糖對DPPH·的清除率隨著多糖濃度的增加而增加，半最大效應濃度（EC50）為0.801 mg/mL。

圖5 多糖對DPPH·清除率的影響

3 結論

本文對石楠藤多糖進行了研究，通過正交試驗確定了最優提取工藝，即提取溫度為80 ℃、提取時間70 min、料液比為1∶50（g ：mL）、醇沉體積分數為70%。深入研究發現，石楠藤多糖對DPPH·表現出較好的清除效果，EC50為0.801 mg/mL。石楠藤作為廣東地區常見的一味中藥材，許多有效成分尚未被人發現，本文對其多糖的提取和抗氧化活性進行了初步研究，為石楠藤資源的深入研究提供了實驗基礎。