Ti3C2Tx-CaCO3復合膜的構建及其成骨活性研究

高雨潔

（成都醫學院第一附屬醫院，四川成都 610500）

骨缺損是口腔種植領域始終面臨的一大困境。諸多長期缺牙患者或者外傷患者常常面臨骨高度或骨寬度不足的情況，骨量不足限制了種植修復的美學與功能恢復，且不利于種植材料的長期穩定性。為了解決骨量不足的問題，臨床上最常見的解決方式是進行GBR骨增量手術，其原理是在骨缺損區域放置骨再生材料，隨后在軟硬組織之間放置屏障膜并關閉軟組織切口。屏障膜作為骨再生領域常用的生物材料，具備阻隔軟組織并維持成骨空間的能力。理想的屏障膜還應具備促進成骨分化的功能，提升骨缺損區域實際成骨效果。

在諸多生物材料中，Ti3C2Tx是一類新型二維納米材料，具有高比表面積及活性基團，包含多種過渡金屬碳化物、氮化物及金屬導電性碳氮化物，具有親水性和良好的機械性能，在生物工程領域逐漸受到研究者的關注[1]。還有一種經典的化合物引起了研究者的注意，CaCO3中的鈣元素是天然骨組織中的重要組分，由于具有良好的生物活性、生物相容性、骨傳導性和高表面活性，已經被廣泛應用于骨組織工程生物材料領域[2]。因此，本研究探索Ti3C2Tx與CaCO3共同構建一類新型屏障膜，兼備機械強度與成骨活性，既可以阻止軟組織侵入成骨空間，還可誘導骨缺損區域前成骨細胞的成骨分化，提升骨增量手術的可預期性，增加成骨速度及成骨效率。

本實驗構建了Ti3C2Tx-CaCO3復合膜，通過掃描電子顯微鏡觀測微觀形貌，并進行細胞學實驗檢測細胞增殖率及堿性磷酸酶活性，分析該材料的生物相容性與成骨活性，探究Ti3C2Tx-CaCO3復合膜在骨再生生物工程領域的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

Ti3AlC2，98%，吉林11科技有限公司；氟化鋰，98%，Sigma；37%濃鹽酸和氯化鈣，分析純，國藥集團；DMEM培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液，Gibco公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒、Hoechst 33342染色劑、RIPA裂解液、堿性磷酸酶試劑盒和BCA蛋白試劑盒，碧云天生物技術有限公司；4%多聚甲醛，Biosharp公司；Triton X100、地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸，Sigma公司。

1.2 實驗設備

GM-0.33A型真空抽濾泵，天津津騰實驗設備有限公司；RCTbasic型恒溫磁力攪拌器，德國IKA公司；Micro17R型臺式高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技有限公司；5702型臺式低速離心機，德國艾本德公司；ME54T/02型電子分析天平，梅特勒托利多公司；Milli-Q型超純水機，德國默克公司；SU6200型掃描電子顯微鏡，日本日立有限公司；Varioskan LUX型酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Ti3C2Tx-CaCO3的制備

將0.8 g氟化鋰與20 mL鹽酸（9 mol/L）混合于聚四氟乙烯瓶中，加入1 g的Ti3AlC2粉末，使用恒溫磁力攪拌器，使混合液在35 ℃連續反應48 h。將反應液放入離心機中，使用去離子水多次離心洗滌（3 500 r/min，每次15 min），直至上清液pH＞6，收集黑色沉淀層（Ti3C2Tx）并重懸于去離子水中。加入CaCl2，使用磁力攪拌器混合均勻，使Ca2+結合于Ti3C2Tx片層表面。向混合液內通入CO2，得到Ti3C2Tx-CaCO3混合分散液。使用真空過濾設備抽濾得到Ti3C2Tx-CaCO3復合膜。放入真空干燥罐中自然干燥24 h，復合膜可從濾膜表面揭下。

1.3.2 Ti3C2Tx-CaCO3的表征

Ti3C2Tx-CaCO3復合膜的表面和橫截面形貌采用掃描電子顯微鏡（SEM）進行觀察。將復合膜裁剪成適當大小，充分干燥，噴金后使用掃描電鏡進行表面微觀形貌觀察。將復合膜進行液氮脆斷處理，保持橫截面完整性，充分干燥，噴金后使用掃描電鏡進行橫截面微觀形貌觀察。

1.3.3 生物相容性檢測

將小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1以細胞密度1×104個/孔分別接種于細胞爬片及復合膜上，在溫度為37 ℃，5% CO2的環境下培養24 h。隨后將細胞和EdU共培養2 h。使用4%多聚甲醛室溫固定15 min。 使 用 0.1% Triton X-100 通 透 15 min。 通過30 min的點擊反應使EdU標記熒光染料。使用Hoechst 33342染色細胞核。將樣本放置在熒光顯微鏡下進行觀察。每組隨機選取5個區域，統計EdU陽性（呈綠色）的細胞數量和總細胞數量（呈藍色），EdU陽性率=EdU陽性細胞數/總細胞數，計算細胞增殖率。

1.3.4 成骨活性檢測

將小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1以細胞密度為1×104個/孔分別接種于細胞爬片及復合膜上，在溫度為37 ℃，5% CO2伴成骨誘導液的環境下分別培養4天和7天。到相應時間節點后，吸去培養基并加入RAPI裂解液，以15 000×g離心12 min以收取總蛋白。首先使用堿性磷酸酶試劑盒，與樣本反應后使用酶標儀測定405 nm處吸光度。接著使用BCA蛋白檢測試劑盒，使用酶標儀測定562 nm處吸光度，定量樣品蛋白總量。最終根據酶活性的定義，計算得到堿性磷酸酶活性值。

1.3.5 統計分析

使用Graphpad Prism軟件對數據進行分析及作圖處理。開展正態性與方差齊性檢驗，組間比較使用單因素方差分析。所有實驗均重復三次，數據以均數±標準差表示。P＜0.05表示差異具有統計學意義，其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，****表示P＜0.0001。

2 結果與分析

2.1 材料的制備與表征

如圖1所示，最終得到的復合膜材料呈完整膜片狀，整體外觀灰黑色，復合膜的伸展性及柔韌性均較良好。使用掃描電子顯微鏡對復合膜表面及橫截面進行微觀觀察，可見表面主要為數百納米的二維片層Ti3C2Tx納米片堆疊，橫截面由球狀CaCO3穿插于Ti3C2Tx片層結構之間，共同構成統一整體。其中，CaCO3微球在片層表面及片層之間分布均勻，大小亦相對均一。研究顯示，Ti3C2Tx表面存在多個可負載其他物質的錨定位點。該復合雜化材料結構穩定，在生物醫藥領域具備應用潛力。

圖1 Ti3C2Tx-CaCO3復合膜外觀形貌圖

2.2 材料的生物相容性

通過EdU試劑盒檢測小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1與復合膜材料共培養后的細胞增殖能力，評價Ti3C2Tx-CaCO3復合膜的生物相容性，對于指導該材料的應用前景具有基礎意義。由圖2可知，復合膜組的細胞具有更高的細胞增殖活性，提示該復合膜材料具有促進細胞增殖的作用。這是由于Ti3C2Tx的組成元素主要為C與Ti，C元素是生物有機體中不可或缺的元素成分，而Ti對生物有機體呈現相對惰性的狀態，這意味著Ti3C2Tx在生物體內相對穩定[3]。而CaCO3早已作為補鈣劑的成分之一應用于臨床，同樣具有良好的生物相容性。實驗結果證實該材料整體無明顯細胞毒性，是生物材料實際應用的重要前提。

圖2 Ti3C2Tx-CaCO3復合膜促細胞增殖活性

總體而言，Ti3C2Tx-CaCO3復合膜具有良好的生物相容性，并具備促進小鼠前成骨細胞增殖的能力，這一結果提示該材料具備在骨再生領域應用的潛力和價值。

2.3 材料的成骨活性

通過堿性磷酸酶試劑盒檢測Ti3C2Tx-CaCO3復合膜對小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1的誘導成骨能力，分析該材料在骨再生組織工程領域的應用潛力。如圖3所示，與對照組相比，復合膜組在第4天和第7天的堿性磷酸酶活性均有顯著提高。

圖3 Ti3C2Tx-CaCO3復合膜成骨活性

堿性磷酸酶（ALP）是硬組織的重要組成成分，也是細胞成骨分化的標志物。實驗證明Ti3C2Tx-CaCO3復合膜具有明確的促進成骨分化功能，這與Ti3C2Tx表面具有豐富錨定位點以便于附著成骨誘導液中相關物質有關[4]，也與CaCO3固有的成骨刺激途徑相關[5]。這一結果確定了該材料的成骨活性，意味著使用該材料作為屏障膜不僅可以起到屏障隔離作用以防止軟組織長入，還可以促進骨組織的快速形成，利于骨缺損區域的恢復，具有極高的應用價值。

3 結論

本實驗所構建的Ti3C2Tx-CaCO3復合膜由Ti3C2Tx納米片夾層球狀CaCO3所構成，具有良好的生物相容性，可顯著促進細胞增殖。此外，該材料可提高堿性磷酸酶活性，具有促進成骨分化的能力，是可應用于骨再生工程的新型生物材料。