溫莪術藥渣再提取工藝及其美白活性研究

夏 禹，張文珍，黃 真，仇鳳梅，鐘曉明

浙江中醫藥大學藥學院，杭州 310053

溫莪術為姜科姜黃屬植物溫郁金CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥主根莖[1]，有抗氧化、抗炎抑菌[2]、抗風濕、抗腫瘤[3]、改善免疫系統功能[4]、抗病毒[5]等多種藥理作用，是具有廣泛應用價值的傳統中藥。溫莪術主要成分為揮發油、姜黃素類、多糖類、酚酸類和生物堿類化合物[6]，其中揮發油占1%～2.5%，是溫莪術主要藥效物質之一，目前已被提取制劑應用于臨床。但是，許多制藥工廠在提取溫莪術油多采用水蒸氣蒸餾法，而此法在提取揮發油時效率較低，導致提油后大量的溫莪術藥渣堆積，且因其暫無有效利用途徑、處理成本高等原因，每年只能將成百上千噸的藥渣當做廢棄物丟棄，嚴重造成資源浪費和環境污染。而有學者[7,8]對溫莪術經水蒸氣蒸餾法提取揮發油所剩藥渣的化學成分進行分析，發現溫莪術藥渣中仍含有多種姜黃素類化合物、莪術二酮等活性成分。而姜黃素類化合物已被證實具有抗菌、抗氧化、美白等生物活性[9-11]，這說明溫莪術藥渣的二次開發利用仍有非常大的可行性。

溫郁金提取物目前已收錄于2021年版《已使用化妝品原料名稱目錄》，然而卻未見其在化妝品領域的相關研究文獻報道。美白作為化妝品最常見的功效宣稱之一，近年來也逐漸受到人們的追捧[12]，而皮膚顏色主要是由黑色素決定的。當細胞受到內源性(如α-MSH)刺激物作用時，會通過多種信號通路誘導小眼畸形相關轉錄因子(MITF)的表達，從而激活酪氨酸酶，促進黑色素的生成。另外，活性氧(ROS)也在黑色素生成過程中起到十分重要的作用，ROS是酪氨酸酶催化氧化過程中的引發劑和反應物，通過相關蛋白的作用誘導黑色素合成基因的表達，導致黑色素含量的升高[13]。故抑制酪氨酸酶活性、抗氧化是目前公認美白的兩個關鍵靶點。

因此，本研究旨在挖掘溫莪術藥渣在化妝品領域上的潛在價值，以其美白活性成分總姜黃素得率為指標，利用響應面法優化溫莪術藥渣的最佳提取工藝，同時考察最佳提取工藝條件下溫莪術藥渣提取物對DPPH、ABTS自由基清除作用和大鼠黑色素瘤B16細胞黑色素合成及酪氨酸酶活性的影響。為擴大溫莪術植物資源的利用及其在化妝品領域應用的開發提供科學依據，并促進各行業二次開發利用中藥渣資源，從而推動地方經濟及產業的進一步發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用溫莪術藥渣于浙江省瑞安市通明溫郁金專業合作社購買。姜黃素對照品(批號：S19245-5 g，杭州高晟生物科技有限公司)；DPPH(批號：GC19475-100 mg，南京翼飛雪生物科技有限公司)；ABTS(批號：S30629-250 mg，北京酷爾化學科技有限公司)；熊果苷標準品(批號：PS0213-25 mg，成都普思生物科技股份有限公司)；甲醇(批號：M116121-500 mL，杭州邦易化工有限公司)；二甲基亞砜(批號：D103271-5 mL，杭州邦易化工有限公司)；MTT(批號：KGT5251-1 g，杭州昊天生物技術有限公司)；DMEM培養基(批號：C11960500BT-500 mL，廈門輝耀興業科技有限公司)；胎牛血清(批號：S9030-500 mL，北京拜爾迪生物技術有限公司)；TritonX-100(批號MB2486-1 g，大連美侖生物技術有限公司)；L-DOPA(批號：HY-N0304-1 g，杭州昕誠生物科技有限公司)；小鼠黑色素瘤細胞(批號：SCC-211111，北京拜爾迪生物技術有限公司)；胰酶(批號：P816199-50g，上海麥克林生化科技有限公司)；PBS(BL302A-500 mL，廣州賽國生物科技有限公司)；水為超純水；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平(型號：AL104，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；旋轉蒸發儀(型號：RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠)；數顯鼓風干燥箱(型號：DHG-9240A，上海帥登儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(型號：HH-8，上海宜昌儀器紗篩廠)；紫外可見分光光度計(型號：UV-1800，杭州宗燦科技有限公司)；酶標儀(型號BLX-800，美國伯騰儀器有限公司)；二氧化碳培養箱(型號：Thermo 3111，美國賽默飛世爾科技公司)。

1.3 溫莪術藥渣總姜黃素類化合物含量測定[14-16]

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取姜黃素對照品1.0 mg，加入甲醇定容至10 mL，即得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

1.3.2 檢測波長的選擇[24]

將姜黃素對照品用甲醇稀釋10倍后置于比色皿中，以甲醇溶液作為空白對照，在200～800 nm紫外波長下掃描對照品溶液發現其在423 nm處有一最大吸收峰(如圖1)，故選用該波長測定溫莪術藥渣總姜黃素吸光度。

圖1 姜黃素對照品紫外掃描圖譜Fig.1 UV scanning spectrum of curcumin reference substance

1.3.3 方法學考察

精密吸取姜黃素對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL。分別加入到10 mL的容量瓶中，再用甲醇定容，震蕩搖勻。測定方法:以甲醇為空白對照，采用紫外可見分光光度計測量各溶液423 nm處的吸光度。以吸光度(A)對姜黃素質量(X)進行回歸，得到回歸方程A=164.43X+0.169(r=0.999 4)，在0.010 6～0.106 mg/mL范圍內線性關系良好。精密度、重復性、穩定性試驗RSD分別為0.84、1.83、1.76%；加樣回收率為97.76%，RSD為1.68%(n=9)。

1.3.4 樣品總姜黃素含量測定

將溫莪術藥渣經烘干研磨后過50目篩，得到溫莪術藥渣粉末，精密稱取1.0 g，加入20 mL的60%乙醇溶液，超聲提取30 min，抽濾兩次后減壓回收溶劑，揮干得到的提取物干品，用甲醇復溶，并定容至100 mL的容量瓶備用，按照“2.1.3”項下測定并計算溶液中總姜黃素濃度，按式(1)計算其得率。

(1)

其中，總姜黃素得率單位為mg/mL，C為根據標準曲線計算溶液中總姜黃素的質量濃度(mg/mL)；d為稀釋倍數；V為定容體積(mL)；M為稱取樣品的質量(g)。

1.4 溫莪術藥渣提取工藝優化

1.4.1 單因素試驗

實驗基礎條件設置為：超聲提取溫度控制在20±1 ℃，液料比20 mL/g，60%乙醇濃度，超聲提取30 min。因素考察設計如下：液料比(10～30 mL/g)；乙醇濃度(50%～90%)；超聲持續時間(20～60 min)。每組各五個梯度，重復三次實驗，考察三個因素對溫莪術藥渣總姜黃素提取得率的影響。

1.4.2 響應面法優化實驗

參考文獻方法[17,18]并修改，響應面實驗通過Design-Expert 8.0.6軟件進行模型的建立與分析，根據單因素試驗結果，選擇合適的三因素三水平，并以總姜黃素得率作為評價指標，共得到17個試驗，每項試驗重復三次。最后，按照模型擬合得出的總姜黃素得率最高的工藝條件進行驗證，對比測得的實際得率與理論值的差異，驗證實驗的準確性。

1.5 DPPH、ABTS自由基清除率測定

參考文獻方法[19]將溫莪術藥渣提取物和陽性對照VC溶于乙醇溶液，均配成濃度為1、2、4、8、16、32、64 μg/mL的待測溶液備用。避光環境下稱取DPPH、ABTS粉末，參照文獻方法[18]配成0.06 mmol/L的DPPH乙醇溶液和ABTS貯備液，將不同濃度的待測溶液依次加入到DPPH乙醇溶液和ABTS貯備液中，避光反應20 min，分別于517 nm和734 nm測定吸光度，重復三次，并按照式(2)計算清除率。

(2)

其中，A0是用空白試劑和DPPH乙醇溶液或ABTS貯備液混合后得到的溶液的吸光度，AS是用供試品溶液和DPPH乙醇溶液或ABTS貯備液混合后得到的溶液的吸光度。

1.6 B16細胞培養

細胞培養參考文獻方法[20,21]并改進，將B16細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基的培養瓶中，于37 ℃，5%CO2恒溫恒濕培養箱中培養，每24 h于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，當細胞貼壁生長至近融合狀態時(鋪滿瓶底80%～90%)，棄去瓶內培養液，用PBS沖洗2次，加入1 mL預溫至37 ℃的0.25%胰酶，于培養箱內進行消化反應2 min，加培養液中止反應，離心處理分離后，將細胞傳代至25 cm2培養瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，于培養箱中繼續培養，重復以上操作可培養至第10代。

1.7 實驗分組

取對數生長期的B16細胞，調整細胞濃度為4×105個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL(空白組不接種B16細胞)，于培養箱培養24 h后，小心吸去各孔上清液，按如下實驗分組進行給藥：正常對照組(normal control，NC)與空白組均加入不含藥DMEM培養基；陽性對照組(positive control，PC)加入含濃度為100 μg/mL熊果苷的DMEM培養基；實驗組分別加入含濃度為50、100、200、400、800、1 600 μg/mL溫莪術藥渣提取物的DMEM培養基，每組設置6個復孔，培養48 h。

1.8 MTT法測定溫莪術藥渣提取物對B16細胞存活率的影響

按“1.7”法分組給藥培養B16細胞48 h后，各孔重新加入新的DMEM培養基100 μL，隨后依次加入20 μL預先配置好濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養4 h。隨后將96孔板內上清液棄去，各孔重新加入150 μL DMSO溶液，震蕩10 min，立即置酶標儀下測定其在490 nm波長下的OD值，重復三次。按式(3)計算細胞存活率

(3)

1.9 黑色素含量測定

取對數生長期的B16細胞經胰酶消化后，調整細胞濃度為4×105個/mL，接種于24孔板中培養24 h后，按照“1.7”下實驗分組依次處理，每組設置3個平行實驗，培養48 h后，收集各孔濃度約2×105個/mL的B16細胞，加入1 mol/L NaOH溶液400 μL，100℃孵育30 min，裂解細胞并讓細胞內黑色素溶出，離心，取100 μL上清液至96孔板中，于酶標儀450 nm波長下測定OD值。按照式(4)求得黑色素含量。

(4)

其中，n為實驗組細胞數量。

1.10多巴氧化法測定B16細胞酪氨酸酶活性

B16細胞酪氨酸酶活性參考文獻方法[22]采用多巴氧化法測定，首先提前配制好1% TritonX-100溶液和0.1% L-DOPA溶液備用，按“1.7”法下分組給藥培養B16細胞48 h后，將96孔板上清液棄去，每孔依次加入100 μL TritonX-100溶液，在-80 ℃溫度下凍存1 h，而后室溫下使其融化裂解，每孔依次加0.1% L-DOPA 100 μL，于37 ℃培養箱2 h，置酶標儀下測定其在490 nm處OD值。重復三次，按式(5)計算細胞酪氨酸酶活性。

(5)

1.11數據統計

實驗結果運用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及分析，GraphPad Prism 6.0.2軟件進行相關圖表的繪制，SPSS 20.0軟件進行數據處理。

2 結果

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對提取得率的影響

實驗結果如圖2A所示。從圖中可以看出，總姜黃素提取得率在乙醇濃度為50～80%時逐漸上升，80%時達到最高，而后有所降低，因此選用乙醇濃度70、80、90%進行后續響應面實驗。

2.1.2 超聲時間對提取得率的影響

實驗結果如圖2B所示。從圖中可以看出，超聲時間在20～50 min時，總姜黃素得率逐漸提升，隨后有所降低，因此選取超聲時間40、50、60 min進行后續響應面實驗。

2.1.3 液料比對提取得率的影響

實驗結果如圖2C所示。從圖中可以看出，當液料比為20 mL/g時，總姜黃素得率最高，而后總姜黃素得率逐漸降低，因此選擇15、20、25 mL/g這三個水平進行后續的響應面實驗。

2.2 響應面實驗結果與分析

以總姜黃素得率作為響應值(Y)，得到的響應面實驗設計方案如表1和表2所示。

實驗結果利用Design Expert 8.0.6軟件對表2實驗數據進行回歸分析，軟件擬合得到的響應面三維圖如圖3所示，獲得響應面方差分析及顯著性結果如表3所示。

由表3方差分析得出，響應面實驗模型P< 0.01，說明實驗模型具有統計學意義并且該模型的擬合度良好(失擬項P> 0.05)。因素A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2對總姜黃素得率均具有極顯著影響(P< 0.001)。以總姜黃素得率為響應值(Y)，得到總姜黃素得率對各影響因素的二項多項式回歸模型為：Y=6.35+0.090×A+0.091×B+0.22×C+0.090×AB-0.015×AC+0.11×BC-0.34×A2-0.20×B2-0.39×C2。各因素對溫莪術藥渣總姜黃素的得率影響程度依次為液料比(C)>乙醇體積分數(A)>超聲時間(B)。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 試驗設計與結果Table 2 Design and results of tests

表3 響應面方差分析Table 3 The response surface analysis of variance(ANOVA)

圖3 各因素響應面圖Fig.3 Response surface plots for various factors

根據回歸模型求解方程得出最優提取工藝為液料比21.65 mL/g，乙醇濃度81.78%，超聲時間53.74 min，模型預測在該實驗條件下總姜黃素得率為6.41 mg/g，為了便于實驗實際操作，驗證實驗以液料比22 mL/g，乙醇體積分數82%，超聲時間55 min為條件，并重復3次實驗再次進行提取，最終測得總姜黃素得率為6.38±0.02 mg/g，與預測值6.41 mg/g接近，與未優化所得5.46 mg/g比較提升14.42%，表明工藝合理穩定，可為后續重復實驗提供參考依據。

2.3 體外抗氧化活性實驗

DPPH自由基清除實驗結果可見圖4A。溫莪術藥渣提取物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而提高，在濃度為32 μg/mL時，清除率達到88.23%，隨后趨于平緩，IC50為24.99 μg/mL。ABTS自由基清除實驗結果可見圖4B。由此可知，溫莪術藥渣提取物對ABTS自由基的清除率也是隨著濃度的增加而升高，存在一定量效關系。溫莪術藥渣提取物對ABTS自由基的清除率在64 μg/mL處接近100%，IC50值為49.72 μg/mL。以上均說明溫莪術藥渣提取物具有良好的體外抗氧化作用。

圖4 不同濃度提取物對DPPH、ABTS自由基清除率Fig.4 Clearance rates of extracts with different concentrations on DPPH and ABTS free radicals

2.4 小鼠黑色素瘤B16細胞實驗結果

2.4.1 不同濃度溫莪術藥渣提取物對B16細胞存活率的影響

MTT結果顯示如圖5，當溫莪術藥渣提取物濃度在50～800 μg/mL時，對細胞存活率的影響與正常對照組沒有顯著性差異，當濃度達到1 600 μg/mL時，細胞存活率顯著下降至80%以下，并且與正常組差異顯著(P< 0.001)。為控制B16細胞凋亡對實驗的影響，因此溫莪術提取物對B16細胞的安全給藥濃度范圍為50～800 μg/mL，選用該濃度范圍進行后續實驗。

圖5 不同濃度提取物對B16細胞存活率的影響Fig.5 Effects of different concentrations of extracts on survival rate of B16 cells注：與正常對照組比較，***P < 0.001。Note:Compared with normal control,***P < 0.001.

2.4.2 不同濃度溫莪術藥渣提取物對B16細胞黑色素合成的影響

由圖6可得，不同濃度的溫莪術藥渣提取物對黑色素瘤B16細胞黑色素合成均具有一定的抑制作用，并且呈一定的濃度依賴性，各實驗組與正常對照組相比，均具有統計學差異(P< 0.05)，細胞給藥處理48 h后，400、800 μg/mL溫莪術藥渣提取物實驗組與正常對照組相比具有極顯著差異(P< 0.001)，兩組的黑色素含量僅為正常對照組的64.94%和41.78%，其中800 μg/mL實驗組抑制黑色素生成作用優于陽性對照組熊果苷，且具有統計學差異(P< 0.05)。

圖6 不同濃度提取物對B16細胞黑色素合成的影響Fig.6 Effects of different concentrations of extracts on melanin synthesis in B16 cells注：與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。與陽性對照組比較，#P < 0.05。Note:Compared with normal control,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001.Compared with positive control,#P < 0.05.

2.4.3 不同濃度溫莪術藥渣提取物對B16細胞酪氨酸酶活性的影響

由圖7可知，與正常組相比，陽性對照組及實驗組的酪氨酸酶活性均顯著降低(P< 0.05)，其中400 μg/mL的溫莪術藥渣提取物實驗組與陽性對照組的酪氨酸酶活性分別為60.98%和61.12%，根據數據分析得出兩組沒有顯著性差異(P> 0.05)，說明溫莪術藥渣提取物抑制酪氨酸酶活性的作用約為熊果苷的四分之一。并且溫莪術藥渣提取物抑制酪氨酸酶活性的作用隨著濃度升高而逐漸增強，與黑色素含量試驗結果一樣存在量效關系(如圖8)，在濃度為800 μg/mL時溫莪術藥渣提取物對B16細胞酪氨酸酶活性抑制率達到最大值51.87%，與陽性對照組相比，具有統計學差異(P< 0.05)。因此，推測溫莪術藥渣提取物可能是通過抑制B16細胞中酪氨酸酶活性或其相關激活通路，進而發揮限制黑色素B16細胞中黑色素合成的作用。

圖7 不同濃度提取物對B16細胞酪氨酸酶活性的影響Fig.7 Effects of different concentrations of samples on tyrosinase activity in B16 cells注：與正常組比較，*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001。與陽性對照組比較，#P < 0.05。Note:Compared with normal control,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001.Compared with positive control,#P < 0.05.

圖8 提取物對B16細胞酪氨酸酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of the extract on B16 cell tyrosinase

3 討論與結論

采用響應面法優化后溫莪術藥渣提取物的最佳提取工藝為液料比22 mL/g，82%乙醇超聲提取，超聲時間55 min，得到總姜黃素平均得率為6.38 mg/g。該工藝條件簡單，操作方便且穩定，可為溫莪術提取揮發油后剩余藥渣中姜黃素類化合物的二次利用提供參考。

此外，以最佳工藝提取制備的溫莪術藥渣提取物具有良好的清除DPPH、ABTS自由基作用，其IC50值分別為24.99、49.72 μg/mL。細胞實驗的結果顯示，50～800 μg/mL各濃度溫莪術藥渣提取物實驗組均能夠有效減少黑色素瘤B16細胞黑色素的含量以及抑制酪氨酸酶活性。

姜黃素類化合物在酸性及中性環境中性質比較穩定，并且易溶于有機溶劑但是不易溶于水[23]。傳統回流提取姜黃素類化合物的方法耗時、提取率低并且不利于保證姜黃素類化合物的生物活性[24]，同時姜黃素類化合物含量的檢測方法也較為復雜，故本實驗通過改良文獻方法[25]采用紫外分光光度法測定總姜黃素類化合物的方法，研究不同液料比、乙醇濃度、超聲時間對其得率的影響，并通過響應面模型優化提取工藝。優化后使溫莪術藥渣中總姜黃素的提取率提高了14.42%。該方法穩定可行，重復性好，也為溫莪術殘渣中姜黃素類化合物的提取工藝優化、測定及二次利用提供了理論依據。

DPPH法及ABTS法為兩大常用的體外抗氧化評價試驗，廣泛用于評價植物提取物的抗氧化性能[19]。本實驗發現溫莪術藥渣提取物在抗氧化方面顯示出良好的作用，并通過細胞實驗進一步驗證發現其對黑色素生成及其關鍵限速酶酪氨酸酶活性的抑制作用良好。后續可以更加深入地研究溫莪術藥渣提取物在細胞、分子水平上的美白機制或進行分離純化得到更安全有效的抗氧化劑或酪氨酸酶抑制劑，為溫莪術藥渣的開發提供科學理論依據。

隨著中藥行業的迅猛發展，在生產中也導致中藥渣的大量產生，秉著我國綠色可持續發展和資源再利用理念，中藥渣也逐漸成為近年來研究的熱點，目前中藥渣已被廣泛用作飼料、添加劑、燃料、吸附劑及肥料等[26,27]，具有很大的開發潛力。因此，本實驗也為加快各行業對中藥渣資源的二次開發利用、實現中藥渣可持續利用奠定基礎。