基于超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學探究大血藤治療腦梗死的有效成分及其潛在作用機制

劉佳利，任 維,2，楊思進,2，湯 潤，毛琳慎，稅丕先*

1西南醫(yī)科大學；2西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000

卒中是造成我國國民減壽的第一病因，嚴重危害國民健康，影響全民健康水平。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展及國民生活水平的提高，腦卒中的發(fā)病率逐年上升且日趨低齡化。根據(jù)發(fā)病類型的不同，腦卒中又分為缺血性卒中與出血性卒中。缺血性卒中又名腦梗死，有數(shù)據(jù)表明，在我國缺血性卒中人群約占卒中總?cè)藬?shù)的85%[1]。因此，如何減少腦梗死發(fā)病率、致殘率、死亡率、恢復(fù)神經(jīng)功能是目前中西醫(yī)學者共同關(guān)注的難點和熱點。

目前，西醫(yī)對腦梗死的治療手段主要為靜脈溶栓、動脈溶栓和機械取栓三種，能為患者短期內(nèi)重建病灶血運、緩解缺氧損傷、減少自由基產(chǎn)生等做出積極貢獻[2]。但部分患者遠期預(yù)后較差，面臨后遺癥、并發(fā)癥等問題。中醫(yī)藥治療腦梗死具有其獨特的優(yōu)勢，其適用范圍廣、副作用小、患者預(yù)后好并能提高神經(jīng)功能恢復(fù)、降低病殘率與復(fù)發(fā)率、提高患者生活質(zhì)量。中醫(yī)認為腦梗死病因病機與氣虛血瘀、痰瘀阻竅等有關(guān)，隨著對中風及“毒邪”的深入認識與研究，有學者提出了“中風熱毒論”“毒損腦絡(luò)”等觀點，認為中風后產(chǎn)生的痰毒、熱毒等均可損傷腦絡(luò)[3]。大血藤為木通科大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.Et Wils植物的干燥藤莖，具有清熱解毒、活血通經(jīng)、祛風除濕等功效，并含有豐富的化學成分，如皂苷類、蒽醌類、有機酸類、木質(zhì)素類、酚類等。常用于治療腸癰腹痛、熱毒瘡瘍、經(jīng)閉、痛經(jīng)、跌撲腫痛、風濕痹痛等[4]。現(xiàn)代藥理學研究表明，大血藤能改善腦海馬和皮質(zhì)區(qū)的損傷，可抑制微循環(huán)灌注量的下降從而減小梗死區(qū)域面積占比，降低死亡率[4]。大血藤總酚酸可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織炎癥反應(yīng)、抑制腦細胞凋亡，同時，可降低腦缺血再灌注損傷大鼠的死亡率、降低神經(jīng)功能缺失評分[5]。通竅化栓方是臨床治療腦梗死的有效組方，其中大血藤為君藥，該方主治功能核心為祛風、祛痰、祛瘀。Cai等[6]臨床研究結(jié)果表明，通竅化栓湯可明顯改善缺血性腦卒中患者的血液流變學指標，可改善血液的黏稠度、凝固性及細胞聚集性，具有理想的抗栓作用。目前，對于大血藤作用于心腦血管疾病的有效成分、作用靶點、作用通路等仍處于探索階段，使得研發(fā)利用及臨床推廣受到了一定限制。因此，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進一步分析大血藤的化學成分，闡明其有效成分作用于腦梗死疾病的治療靶點及作用通路，為深入研究大血藤治療腦梗死提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Ultimate 3000超高效液相色譜儀(含自動進樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機、低壓四元梯度泵、PDA檢測器)，美國Waters公司；LTQ Orbitrap velos pro高分辨質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司。大血藤飲片購自四川金方生物醫(yī)藥科技有限公司，批號：170987，產(chǎn)地：四川。表兒茶素、紅景天苷(純度均>98%)購自賽百草科技有限公司(北京，中國)，批號SH19052904、19042901；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(HPLC級)，美國Thermo Fisher Scientific公司；超純水，美國Millipore 公司；其他試劑均為分析純。

1.2 大血藤提取物溶液制備

中藥大血藤，經(jīng)西南醫(yī)科大學中藥學教授稅丕先鑒定為正品。大血藤粉碎，過3號篩。取粉末10 g，加8倍量無水乙醇，超聲提取0.5 h(250 W，40 kHz)，冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次提取操作，合并上清液A。濾渣加10倍量水超聲提取1 h(250 W，40 kHz)。冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取兩次，合并上清液B備用。上清液A、B合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍真空干燥，獲得大血藤提取物。精密稱取大血藤粉末1 g，置于25 mL錐形瓶中，加入75%甲醇20 mL，精密稱定，超聲提取1 h，冷卻后用75%甲醇補足減失重量，搖勻。以0.22 μm微孔濾膜濾過，得供試品待測液。

1.3 標準品溶液制備

精密稱取表兒茶素、紅景天苷標準品溶液各1.00 mg，分別置于5.00 mL量瓶中，加適量甲醇稀釋，定容至刻度，配成濃度為200 μg/mL的標準品儲備液。檢測前用甲醇稀釋儲備液10倍，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：HSS T3柱(1.8 μm，2.1 mm ID × 150 mm，Waters)；35 ℃柱溫；樣品盤溫度4 ℃；流動相A：水(含0.1%甲酸)；B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫條件：0～5 min，2% B；5～8 min，2%→20% B；8～45 min，20%→55% B；45～52 min，55%→100% B；52～58 min，100% B；58～58.5 min，100%→2% B；58.5～65 min，2% B；進樣量3 μL，流速0.2 mL/min。

1.5 質(zhì)譜條件

對于高分辨質(zhì)譜LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀，電噴霧(ESI)離子源參數(shù)設(shè)定如下：負離子掃描和正離子掃描模式，加熱器溫度為300 ℃，毛細管溫度為350 ℃，毛細管電壓為35 V，噴霧電壓為± 3.5 kV，鞘氣(N2)流速為35 arb，輔助氣(N2)流速為10 arb；樣品一級質(zhì)譜分別在正負離子模式下進行全掃描(分辨率R為60 000，m/z掃描范圍為100～1 500)，二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(data dependent scan，DDS)。數(shù)據(jù)采集和分析采用Xcalibur，Mass Frontier 7.0軟件。

1.6 預(yù)測大血藤活性成分的靶點

利用中藥分子機理生物信息學分析工具(Swiss Target Prediction)，針對鑒定出的大血藤活性成分進行靶點的預(yù)測計算與匹配，選擇Probability≥0.05的靶點作為候選基因。

1.7 獲得腦梗死的疾病治療靶標

以“Cerebral ischemia”“Cerebral infarction”等相關(guān)詞段為關(guān)鍵詞和搜索條件，在2個疾病靶點數(shù)據(jù)庫(OMIM數(shù)據(jù)庫，http://www.omim.org/；GeneCards數(shù)據(jù)庫，https://www.genecards.org/)中進行檢索，檢索出腦梗死疾病在數(shù)據(jù)庫中的疾病靶點并去除重復(fù)基因，獲得腦梗死疾病的蛋白靶點。

1.8 分析“大血藤-潛在靶標-腦梗死”蛋白質(zhì)相互作用并構(gòu)建拓撲網(wǎng)絡(luò)

利用String數(shù)據(jù)庫，將成分和疾病交集的靶標進行檢索處理，物種設(shè)置為“Homo sapiens(人類)”，最低相互作用閾值設(shè)置為0.9，其余默認，得到靶標蛋白間的相互作用信息。將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并使用其中的Network Analyzer計算拓撲參數(shù)，以betweenness centrality、closeness centrality、degree三個參數(shù)的中值為閾值以篩選大血藤治療腦梗死的核心靶點。

1.9 識別功能模塊、注釋生物學信息、分析富集通路

利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行g(shù)ene ontology(GO)與KEGG分析，根據(jù)P<0.05篩選得出排列前二十位的生物過程(biological progress，BP)、細胞成分(cell component，CC)、分子功能(molecular function，MF)及KEGG結(jié)果，并使用R語言軟件進行結(jié)果可視化操作。

1.10 采用分子對接驗證

選擇相互作用網(wǎng)絡(luò)中degree值靠前的5個靶點，選取其相應(yīng)的化學成分，在Pubchem數(shù)據(jù)庫中下載化合物結(jié)構(gòu)，并從PDB數(shù)據(jù)庫中獲得所對應(yīng)蛋白復(fù)合物的3D結(jié)構(gòu)。利用軟件Discovery Studio 2019中的CDOKCER方法，使用半柔性分子對接方法，導(dǎo)入蛋白及化合物結(jié)構(gòu)后，使其能量最小化，并進行加氫、去水等操作，選取活性位點、去除原始配體，構(gòu)建分子對接模型，并分析對接結(jié)果。以結(jié)合能(-CDOKCER interaction energy，-CIE)>0為界，值越大，提示二者間相互作用能越強。

2 結(jié)果

2.1 大血藤主要化學成分

將大血藤供試品溶液和標準品混合溶液按上述條件下的色譜及質(zhì)譜條件進行UPLC-HR-MS分析，得到正、負離子模式下的總離子流圖(typical total ion chromatograms，TICs，見圖1)，響應(yīng)均良好。利用Xcalibur Qual Browser軟件，對正、負離子模式下采集的大血藤提取物進行分析，根據(jù)化合物正負離子模式下的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、同位素豐度、標準品比對確認，結(jié)合碎片信息、標準品裂解規(guī)律及已有文獻報道，共鑒定及推測得到大血藤提取物中化合物共20種(見表1)，包括苯丙素類、蒽醌類、酚酸類、三萜類等。其中酚酸類12種，苯丙素類4種，蒽醌類3種，三萜類1種。20種化合物中，表兒茶素和紅景天苷為通過對照品比對確認，有一級及二級碎片的13個化合物為根據(jù)其二級碎片及裂解規(guī)律及文獻比對確認，沒有碎片峰的5個化合物為根據(jù)其一級高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、同位素豐度及與文獻比對確認。

圖1 正(A)、負(B)離子檢測模式下的大血藤總離子流圖Fig.1 TICs of Sargentodoxa cuneata in the positive(A) and negative(B) ion mode

表1 大血藤提取物UPLC-HR-MSn數(shù)據(jù)Table 1 UPLC-HR-MSn in the positive and negative ion mode data of the compounds detected in S.cuneata

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 大血藤化學成分篩選及靶點預(yù)測

共篩選活性化合物19種，包括酚酸類化合物如紅景天苷、原兒茶酸、沒食子酸、羅布麻寧、丁香酸葡萄糖苷，苯丙素類化合物如綠原酸、N-反式阿魏酰酪胺，蒽醌類化合物大黃素、大黃酚，甾體類化合物如胡蘿卜苷，三萜皂苷類如齊墩果酸等。這些化合物有耐缺氧、抗炎等藥理作用，提示篩選的成分與文獻報道基本一致。并從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中共匹配預(yù)測到相關(guān)靶點393個。

2.3 疾病靶標的預(yù)測

通過OMIM及GeneCards兩個數(shù)據(jù)庫，共獲得3 288個腦梗死疾病相關(guān)的靶點。

2.4 “活性成分-靶點”的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選

取上述兩者的交集，作為大血藤治療腦梗死的潛在靶點，輸入至String數(shù)據(jù)庫中，進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(見圖2)，得到266個蛋白、1 073條互作連線的蛋白網(wǎng)絡(luò)，并將分析結(jié)果導(dǎo)入至Cytoscape軟件中，構(gòu)建大血藤的“活性成分-靶點”(見圖3)，該網(wǎng)絡(luò)由285個節(jié)點和908條邊構(gòu)成，紅色“V”形為大血藤活性化合物，藍色矩形為潛在靶點。并依據(jù)betweenness centrality、closeness centrality、degree三個參數(shù)，共篩選出核心靶點71個，包括PIK3CA、SRC、STAT3等。并按照degree對19種活性成分進行排序，發(fā)現(xiàn)二氫愈創(chuàng)木脂酸、大黃酚、紫羅蘭酮苷、大黃素甲醚排在前列(見表2)。

2.5 GO富集分析

GO富集分析分為三個模塊，即生物過程BP，MF和CC。BP顯示靶基因主要集中在肽基酪氨酸磷酸化及自磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation、peptidyl-tyrosine autophosphorylation)、血小板激活(platelet activation)、上調(diào)細胞增殖(positive regulation of cell proliferation)、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(phosphatidylinositol-mediated signaling)、酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)等(見圖4)。

MF主要與α2-腎上腺素能受體活動(alpha2-adrenergic receptor activity)、生長因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)、血小板活化因子受體活性(platelet activating factor receptor activity)等有關(guān)(見圖5)。

圖2 核心靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The core target network of S.cuneata for cerebral ischemia

圖3 大血藤化合物-靶點圖Fig.3 “Ingredient-target network” of S.cuneata注：紅色為大血藤活性化合物，藍色為各個化合物對應(yīng)的靶點。Note:The red section is on behalf of the S.cuneata compounds,the blue section represents prediction targets.

表2 排名前20大血藤治療腦梗死的核心靶點拓撲信息Table 2 Topological information of the top 20 core targets in the treatment of cerebral infarction by S.cuneata

CC主要由分選內(nèi)體(sorting endosome)、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物(phosphatidylinositol 3-kinase complex)、內(nèi)體腔(endosome lumen)、偽足(pseudopodium)等組成(見圖6)。

圖4 核心靶點的GO-BP富集分析Fig.4 GO-BP enrichment analysis on core targets

圖5 核心靶點的GO-MF富集分析Fig.5 GO-MF enrichment analysis on core targets

圖6 核心靶點的GO-CC富集分析Fig.6 GO-CC analysis on core targets

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，大血藤對腦梗死的藥理作用涉及通路包括缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、神經(jīng)鞘脂類(sphingolipid)、響應(yīng)胰島素、ErbB、FOXO、催乳素(prolactin)、雌激素(estrogen)等生物信號通路(按P值排序，見圖7)。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對接驗證

采用PIK3CA、SRC、APP、MAPK3、STAT3的分子對接模型與大血藤成分進行對接(見表3)，共對接22對。根據(jù)對接分值，選取排名前三進行分析。

3，4-二羥基苯乙醇葡萄糖苷與APP主要以以下方式結(jié)合：與A鏈的GLY-11、THR-72、ARG-128、ILE-126、ASP-32形成氫鍵，與A鏈的LYS-107、PHE-108、SER-35、TYR-185形成碳氫鍵，與A鏈的TYR-71形成π-烷基鍵。紫羅蘭酮苷與PIK3CA主要以以下方式結(jié)合：與A鏈的ARG-1770、SER-1774、ASP-1933、LYS-1776、LYS-1802形成氫鍵，與A鏈的MET-1772形成烷基，與A鏈的MET-1922形成二硫鍵。紫羅蘭酮苷與STAT3主要以以下方式結(jié)合：與A鏈的ASP-181、ARG-221、ARG-254、ARG-24、ASP-48形成氫鍵，與A鏈的ILE-219、MET-258形成烷基(見圖8)。

表3 小分子與靶點蛋白的分子對接結(jié)果Table 3 The docking result of small molecules with targets

3 討論與結(jié)論

通過構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中對度值排名前5的成分：二氫愈創(chuàng)木脂酸、大黃酚、紫羅蘭酮苷、胡蘿卜苷、大黃素甲醚進行成分分析。二氫愈創(chuàng)木脂酸對血小板活化因子受體結(jié)合有阻斷作用，從而防止血小板凝集造成血栓的形成[18]。大黃酚可能通過抑制Bax蛋白表達水平，減少Beclin1蛋白產(chǎn)生，減輕神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[19]。胡蘿卜苷神經(jīng)保護作用與上調(diào)抗氧化蛋白，抑制P38絲裂原活化蛋白酶、應(yīng)激活化蛋白激酶信號通路的活化有關(guān)。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜苷具有促神經(jīng)干細胞增殖的作用[20]。大黃素甲醚可通過降低IL-1β、TNF-α、ICAM-1的表達，抑制Caspase-3的活性，從而減少神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[20]。

圖8 分子對接模型Fig.8 Molecular docking model注：A：綠原酸甲酯-APP；B：大血藤苷E-PIK3CA；C：大血藤苷E-STAT3。Note:A:3,4-Di-O-caffeoylquinic acid methyl ester-APP;B:Cuneataside E-PIK3CA;C:Cuneataside E-STAT3.

根據(jù)篩選出的71個核心靶點，并對PIK3CA、Src、STAT3、JAK2等degree值較大的靶點進行文獻分析。PIK3CA是PI3K/Akt/mTOR途徑的中心分子，與細胞增殖、血管生成和腫瘤發(fā)生有關(guān)。有研究表明，PIK3CA蛋白在OGD/R(氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo))的SH-SY5Y(人神經(jīng)母細胞瘤細胞)和腦組織中的表達明顯受到抑制，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，可有效提高PIK3CA表達水平從而減少線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[21]。星形膠質(zhì)細胞(Src)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細胞，在腦梗死發(fā)生后，其能激活成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，并形成膠質(zhì)瘢痕。有研究表明Src是Ang II誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞激活的上游信號，其中Src可激活ERK1/2來刺激星形膠質(zhì)細胞的生長，在腦損傷過程中發(fā)揮重要作用[22]。JAK2/STAT3的激活與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。有研究表明，JAK2作為STAT3的上游信號分子，其能調(diào)節(jié)STAT3的磷酸化，從而介導(dǎo)STAT3激活的下游生物反應(yīng)。JAK磷酸化抑制劑可降低缺血大腦組織中JAK2和STAT3磷酸化水平，從而降低細胞凋亡率，縮小梗死面積[23]。HSPs是因受有害刺激后細胞產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白，與腫瘤的產(chǎn)生、增殖及分化有關(guān)。有研究報道，HSP90α能在一定程度上保護缺氧神經(jīng)細胞，并提高細胞耐缺氧能力，為半暗帶內(nèi)的血管再生爭取了時間[24]。綜上，預(yù)測的核心靶點參與了腦梗死的發(fā)病機制，分析結(jié)果與大血藤、腦梗死等相關(guān)報道較為一致，推測大血藤化學成分可通過作用于這些核心靶點，從而發(fā)揮潛在的治療機制。

通過KEGG富集分析結(jié)果可知，大血藤可能通過HIF-1信號通路、sphingolipid信號通路、ErbB信號通路等發(fā)揮防治腦梗死的作用。其中HIF-1信號通路是調(diào)節(jié)細胞應(yīng)對缺氧狀態(tài)的主要分子，其在細胞低氧狀態(tài)時較敏感[25]。目前已發(fā)現(xiàn)HIF途徑可直接刺激活化近80種基因，其誘導(dǎo)的蛋白表達主要表現(xiàn)為提高缺氧細胞耐受力和存活力。Sphingolipid(神經(jīng)鞘脂類)在神經(jīng)生長分化過程中具有重要地位，外源性神經(jīng)鞘脂類已被證實具有廣泛的神經(jīng)保護作用，其能發(fā)揮腦保護作用，并促進受損神經(jīng)的修復(fù)等。有研究顯示，靜脈溶栓后配合神經(jīng)鞘脂類注射液比單行靜脈溶栓術(shù)的神經(jīng)功能恢復(fù)更好。在衰老過程和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過程中，大腦中的神經(jīng)酰胺水平會逐漸增加，并介導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮修復(fù)作用[26]。NRG/ErbB信號通路在腦梗死的保護作用機制中發(fā)揮著重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，在受到創(chuàng)傷的大腦組織中，神經(jīng)細胞里的NRG-1β及ErbB受體會被誘導(dǎo)。ErbB信號能拮抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的產(chǎn)生，保護大腦神經(jīng)元。還有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以通過調(diào)節(jié)NRG/ErbB通路，提高ErbB的表達水平，在一定程度上抑制神經(jīng)元的凋亡及炎癥因子的釋放與表達，還可抑制單核細胞浸潤、星形膠質(zhì)細胞活化后與細胞因子產(chǎn)生，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)，保護神經(jīng)元細胞的作用[27]。上述幾條通路主要參與了氧化應(yīng)激過程、神經(jīng)修復(fù)、細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程，可進一步推測大血藤化學成分可通過調(diào)節(jié)這些通路發(fā)揮治療腦梗死的作用機理。此外，分子對接的結(jié)果，初步模擬了成分與靶點間的相互作用關(guān)系，在一定程度上驗證了上述預(yù)測結(jié)果的可靠性[28]。

綜上，本研究通過結(jié)合UPLC-HR-MS、網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接等方法，對大血藤化學成分及治療腦梗死的作用靶點、生物通路進行了研究與分析，構(gòu)建了化學成分靶點間的相互作用關(guān)系并進行了驗證。多方位闡釋了大血藤通過多靶點、多通路機制發(fā)揮治療腦梗死疾病的作用機制，且相關(guān)預(yù)測與文獻報道相符，為未來深入研發(fā)大血藤治療腦梗死的作用機制提供了基礎(chǔ)與證據(jù)。