化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料快速篩選大黃降血脂活性成分

邊惠琴，武曉玉,2,3*，夏鵬飛,2,3，段文達，楊飛霞，李嬌嬌，趙 磊,2,3*

1甘肅中醫藥大學藥學院；2甘肅中醫藥大學 甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室；3甘肅中醫藥大學 甘肅省道地藥材質量標準化研究與推廣工程實驗室，蘭州730000

傳統中藥活性成分篩選以活性追蹤為主，其以單體組分為篩選對象，存在工作量大、操作繁瑣、效率低等缺點。而與傳統活性追蹤法相比，細胞膜色譜(cell membrane chromatography，CMC)是近年發展迅速的一種生物親和色譜技術，具有特異性識別和高效分離的特性。CMC基本原理是將細胞膜結合到硅膠載體表面制成固定相，細胞膜受體可與藥物分子產生特異性結合，利用色譜分析法研究藥物分子與細胞膜受體的相互作用規律[1,2]。CMC集合了色譜技術、細胞分子生物學及受體藥理學的優點，實現了色譜柱內近似動態地模擬藥物活性成分在體內的作用過程；相比于常用吸附劑(如：離子交換樹脂、大孔吸附樹脂等)，CMC具有色譜分離與活性篩選相結合的優勢，且操作方便、快速穩定、靈敏度高，尤其適用于中藥等復雜體系的活性成分篩選。

細胞膜色譜制備時，根據細胞膜與硅膠載體的不同結合形式，可將其分為：物理吸附和化學修飾。物理吸附細胞膜生物親和色譜是利用細胞膜自身的融合作用和硅膠表面硅羥基的吸附作用制備而成；這種作用力比較弱，細胞膜易從載體上脫落，導致色譜柱壽命短[3,4]。化學修飾細胞膜生物親和色譜是硅膠和細胞膜以共價鍵結合；硅膠的硅醇基與硅烷偶聯劑發生縮合反應引入氨基，氨基與戊二醛分子發生交聯反應，硅膠表面即可得到一端游離的醛基官能團；細胞膜上含有大量氨基基團，在室溫環境中易發生醛氨縮合反應，從而達到硅膠和細胞膜共價連接的目的。化學修飾細胞膜生物親和色譜中載體硅膠與細胞膜共價鍵連接、比較穩定、細胞膜不易脫落，可延長色譜柱壽命[5,6]。

大黃是甘肅道地藥材，為臨床常用中藥之一；具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血脂等藥理作用[7-9]。許多學者及課題組前期研究均證實了大黃降血脂作用，且本課題組利用高脂血癥大鼠篩選出降血脂有效部位為30%乙醇提取液，但其具體藥效物質基礎尚不明確[10-12]；課題組也制備了物理吸附L02肝細胞膜生物親和色譜材料，但其細胞膜脫落較嚴重，使用次數有限。鑒于此，本實驗制備APTES修飾硅膠為載體的L02肝細胞膜生物親和色譜材料，利用細胞膜表面的靶點對大黃30%乙醇提取液中化學成分進行特異性吸附，HPLC分析吸附前后各化學成分色譜峰變化，以色譜峰峰面積變化率為依據，快速篩選大黃降血脂活性成分；并考察該材料的重復使用性能，為高通量篩選大黃降血脂藥效物質基礎提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

85-2型恒溫磁力攪拌器(海司樂儀器有限公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；Waters Alliance型高效液相色譜儀(四元泵、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器)；IMARK酶標儀(美國Bio-Rad公司)；ALPHA-T紅外光譜儀(布魯克儀器有限公司)；高速冷凍離心機(美國Beck-man-Coulter公司)；JY92-ⅡDN細胞破碎儀(寧波新芝科技股份有限公司)；DGX-9143BC-1型電熱恒溫干燥箱(上海福瑪試驗設備有限公司)。

1.2 實驗試劑

硅膠(5 μm，批號：20190316，中國青島美高化工有限公司)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，批號：SLBB5978V)、油酸(批號：SLBRI87V)均購自SIGMA公司；磷酸鹽緩沖溶液(批號：AQ29629583)、鏈霉素/青霉素(批號：20201116)、胰酶(批號：20210629)、1640培養液(批號：AG29643109)、胎牛血清(批號：21040702)、1M Tris-HCl溶液(批號：20190821)、BCA蛋白試劑盒(批號：20191022)、Na+、K+-ATP酶試劑盒(批號：20200629)均購于Solarbio公司；BSA蛋白粉(批號：3131053，購于YESEN公司)；戊二醛(批號：EU2RDH1X，薩恩化學技術(上海)有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(Merk公司)；人L02肝細胞(普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 L02肝脂肪變性細胞膜提取[13]

0.5 mmoL/L油酸刺激L02肝細胞，建立脂肪變性模型；利用差速離心法提取細胞膜，具體步驟如下：1 mL PBS洗滌L02肝脂肪變性細胞，棄去PBS；加1 mL 0.25%胰酶消化，輕輕吹打混勻，在鏡下觀察細胞全部脫落；再加1 mL PBS終止消化，160 × g、4 ℃下離心10 min，保留細胞沉淀；用1 mL PBS洗滌細胞沉淀2次。細胞沉淀在50 mM Tris-HCl溶液中溶脹30 min，在破碎功率720 W、破碎時間2 s，冷卻間隔2 s的冰浴條件下，破碎3 min；細胞碎片混懸液在1 000 × g、4 ℃下離心10 min，保留上清液；上清液進一步在12 000 × g、4 ℃下離心20 min，即得細胞膜沉淀。

1.4 化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料的制備及表征[5]

稱取硅膠2 g，在105 ℃活化2 h。

精密稱取活化硅膠1 g，加100 mL甲苯、1 mL APTES，N2保護、110 ℃條件下加熱回流12 h；反應結束后，5 000 × g離心3 min，甲苯沖洗沉淀；沉淀加50 mL 5%戊二醛甲醇溶液，常溫下攪拌反應2 h，反應結束后，5 000 × g離心3 min，甲醇沖洗沉淀；50 ℃真空干燥，得APTES修飾硅膠。

取APTES修飾硅膠0.1 g置于圓底燒瓶中，加5 mL L02肝脂肪變性細胞膜混懸液，渦旋3 min， 10 Mbar、0 ℃條件下攪拌反應1 h；然后放入4 ℃冰箱中反應12 h。反應結束后，1 000 × g、4 ℃條件下離心10 min，保留沉淀；PBS洗滌沉淀，1 000 × g，4 ℃條件下離心10 min，即得化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料。采用掃描電鏡和紅外光譜對其表征，并測定細胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力。

1.5 吸附、解吸附

化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料加1 mL大黃30%乙醇提取液，輕輕吹打并渦旋震蕩1 min，37 ℃孵育8 h；孵育液在1 000 × g，4 ℃下離心10 min，上清液即共孵育殘液。

化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料加1 mL蒸餾水，輕輕吹打并渦旋震蕩1 min，1 000 × g，4 ℃下離心10 min，上清液即洗滌液。

化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料加1 mL PBS溶液，37 ℃孵育6 h，孵育液在1 000 × g，4 ℃下離心10 min，上清液即解離液。

HPLC分析條件：ODS柱(15 mm ( 4.6 mm，μm)；流動相：0.05%甲酸水(A)，乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～10 min，5%→0% B；10～15 min，20% B；15～30 min，20%→30% B；30～50 min，30%→50% B；50～60 min，50%→85% B；60～65 min，100% B；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

1.6 重復使用性能評價

為了考察該材料的重復使用性能，對化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料進行6次吸附、解吸附實驗，用細胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力來評價重復使用性能。具體過程如下：該材料加1 mL大黃30%乙醇提取液，渦旋混勻，37 ℃孵育8 h；孵育液1 000 × g，4 ℃下離心10 min，保留沉淀；沉淀加1 mL PBS溶液，37 ℃孵育6 h，孵育液在1 000 × g，4 ℃下離心10 min，保留沉淀；測定沉淀(解吸附后)的細胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力；重復測定6次。

2 結果與討論

2.1 表征分析

硅膠、APTES修飾硅膠、化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料掃描電鏡圖見圖1。

圖1 掃描電鏡圖(×10 000)Fig.1 SEM images of silica gel (×10 000)注：a.硅膠；b.APTES修飾硅膠；c.化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料。Note:a.The silica gel;b.APTES modified silica gel;C.Chemical modification L02 liver membrane bioaffinity material.

圖1a中硅膠表面光滑，APTES修飾硅膠(圖1b)表面有一層絮狀物，較圖1a硅膠表面粗糙，推測為APTES烷氧基與硅膠硅羥基反應所致。圖1c表面明顯覆蓋有一層細胞膜，說明APTES修飾硅膠上的游離醛基與細胞膜表面氨基發生醛氨縮合反應，細胞膜鍵合到硅膠表面，推斷化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料制備成功。硅膠、APTES修飾硅膠、化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料紅外光譜圖見圖2。

圖2 紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectrum 注：a.硅膠；b.APTES修飾硅膠；c.化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料。Note:a.The silica gel;b.APTES modified silica gel;C.chemical modification L02 liver membrane bioaffinity material.

圖2a中3 434 cm-1處為Si-OH特征吸收峰，1 114 cm-1是Si-O-Si的反對稱伸縮振動吸收峰，802 cm-1和466 cm-1為Si-O-Si搖擺振動和彎曲振動吸收峰。APTES修飾硅膠(圖2b)在2 942 cm-1處出現氨基硅烷的N-H伸縮振動特征吸收峰，1 884 cm-1處出現N-H變形振動吸收峰[14]。圖2c中3 442 cm-1吸收峰變寬，推測是Si-OH與細胞膜上-NH2蒂合所致，且802 cm-1和466 cm-1處Si-O-Si搖擺振動和彎曲振動吸收峰也消失，說明硅膠與細胞膜上氨基發生反應，所以化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料成功制備。

將硅膠、APTES修飾硅膠、化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料分別混懸于1 mL生理鹽水中，利用細胞膜蛋白試劑盒及Na+、K+-ATP酶試劑盒測定細胞膜蛋白含量和Na+、K+-ATP酶活力，結果見表1。

表1 細胞膜蛋白含量和 Na+、K+-ATP酶活力結果表(n=3)Table 1 Results of membrane protein content and Na+,K+-ATP activity(n=3)

由表1可知，硅膠和APTES修飾硅膠細胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力均為0；化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料由于引入細胞膜，其細胞膜蛋白含量為0.385 2 mg/mL，Na+、K+-ATP酶活力為8.017 0 U/mgprot，表明化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料具有活性。

2.2 降脂活性成分篩選[15]

大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、混合對照品溶液、洗滌液、解離液的HPLC圖見圖3。

由圖3a可知，大黃30%乙醇提取液中各化學成分色譜峰峰形對稱，分離度良好，說明優化的色譜條件穩定可行。圖3b可以看出化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料吸附后，部分化學成分色譜峰峰面積減小，說明該成分和材料發生了特異性吸附。通過與混合對照品溶液化學成分保留時間及紫外光譜學特征進行對比，初步確定1、2、4、5、7、8、9、10、11號色譜峰分別為蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚；3、6號色譜峰為未知成分。圖3d洗滌液中沒有出現色譜峰，說明特異性吸附成分與化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料結合牢固。圖3e解離液中色譜峰極小，分析原因可能是特異性吸附成分和細胞膜上受體相結合，進入到細胞膜內部，進而造成解離液中色譜峰較小。

將6份共孵育殘液進樣分析，考察色譜峰峰面積的穩定性，結果見表2。

由表2可知，共孵育殘液中11個色譜峰峰面積RSD值均小于1%，表明在優化色譜條件下，化學成分峰面積大小穩定。

通過測定大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液中各化學成分峰面積，按照公式1計算色譜峰峰面積變化率，以峰面積變化率大于15%為依據，篩選特異性吸附成分，結果見表3。

圖3 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms 注：a.大黃30%乙醇提取液；b.共孵育殘液；c.混合對照品溶液；d.洗滌液；e.解離液。 Note:a.30% ethanol extract of Rheum palmatum L.;b.Co-incubate residual liquid;c.Reference solution;d.Washing liquid;e.Desorption solution.

表2 共孵育殘液峰面積變化表(n=6)Table 2 Peak area change of co-incubate residual liquid (n=6)

續表2(Continued Tab.2)

表3 化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料吸附差異結果表 Table 3 Results of adsorption difference of chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material

由表3可知，大黃30%乙醇提取液中有11個色譜峰峰面積變化率大于15%，說明化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料對11種化學成分發生特異性吸附，包括4個蒽醌糖苷、2個未知成分(3號和6號色譜峰)及5個蒽醌苷元。1～ 4號色譜峰變化率雖較7～11號小，但實際峰面積差值遠比7～11號大；造成其變化率小的原因在于：峰面積變化率計算公式中，大黃30%乙醇溶液峰面積在分母位置，峰面積大進而導致變化率小。結合峰面積變化率及峰面積差值，11種活性成分中1～4號色譜峰是主要的特異性成分，即蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及未知成分1可作為潛在活性成分進行降血脂活性驗證。

為進一步驗證對解離液中特異性吸附成分進入細胞膜內部的推測，將化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料加1 mL PBS溶液，超聲10 min(超聲功率16 kHz)，1 000 × g，4 ℃下離心10 min，收集上清液，HPLC色譜圖見圖4。

由圖4可看出，采用超聲法對化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料表面細胞膜進行破碎后，PBS溶液中出現被特異性吸附的11個化學成分色譜峰，證實上述推斷合理性。

2.3 重復使用性能評價

化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料進行6次吸附實驗后，細胞膜蛋白含量及Na+、K+-ATP酶活力結果見圖5。

圖4 化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料超聲破碎液HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of ultrasonic crushing solution of chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material

圖5 化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料重復使用性能評價Fig.5 Effect of the regeneration cycles on the chemically modified L02 liver membrane bioaffinity material注：a.細胞膜蛋白含量；b.Na+、K+-ATP酶活力。Note：a.Cell membrane protein content;b.Na+,K+-ATP ezyme activity.

由圖5可知，化學修飾L02肝細胞膜生物親和材料重復使用6次，細胞膜蛋白含量下降11.1%，Na+、K+-ATP酶活力下降12.1%，兩者均未發生顯著降低，說明該材料重復使用性能良好。

3 結論

硅膠與APTES、戊二醛依次發生交聯、縮合反應，通過共價鍵將硅膠和細胞膜進行連接，制備APTES修飾硅膠為載體的L02細胞膜生物親和材料，掃描電鏡和紅外光譜均證明制備成功。APTES修飾L02細胞膜生物親和材料對大黃30%乙醇提取液進行吸附，結果顯示11個成分可被特異性結合；包括4個蒽醌糖苷、5個蒽醌苷元及2個未知成分，其中蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷及未知成分1是主要的特異性成分，可作為潛在活性成分進行降血脂活性驗證。但由于細胞膜表面靶點眾多，本材料僅適用于降血脂活性成分的初步篩選；且后期需要利用LC-MS/MS對2個未知成分進行初步結構鑒定。相比于物理吸附L02細胞膜生物親和材料，該材料通過引入化學共價鍵，一定程度上避免了細胞膜的脫落，延長使用次數，可用于大黃降血脂活性成分的快速篩選，該材料也可為其他降血脂活性成分的快速篩選提供參考。