無償獻血者ELISA-NAT+標本核酸鑒別/拆分結果研究

李沖 肖改娥 王儒意 張博 李宏

(1.陜西省商洛市中心血站檢驗科,陜西 商洛 726100;2.西安市中心醫院檢驗科,陜西 西安 710003;3.安康市人民醫院檢驗科,陜西 安康 725000;4.陜西省安康市中心血站檢驗科,陜西 安康 725000)

目前，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行病毒抗原或抗體的檢測是采供血機構普遍采用的篩查策略，隨著試劑靈敏度的不斷提高，經輸血傳播病毒的風險已降至很低，但由于免疫學方法的局限性，漏檢的現象仍會發生，使臨床用血安全存在隱患[1-2]。因此，越來越多的采供血機構開始在血液篩查中引入核酸擴增檢測技術(NAT)。我國從2010年開展血站核酸檢測試點工作，2012版血站技術操作規程開始把核酸檢測技術納入血液篩查策略，鼓勵有條件的地區和單位率先開展核酸檢測[3-4]。本文用NAT對兩種ELISA試劑檢測乙型肝炎病毒(HBV)標志物后陰性的標本進行核酸檢測及鑒別試驗，并對兩種ELISA試劑檢測結果進行整理和分析，為采供血機構同行選擇HBV感染標志物檢測策略提供一些參考建議。報告如下。

1 資料與方法

1.1血液樣本 隨機抽取2017年6月至2019年6月本實驗室收集的120份無償獻血者血液標本，獻血者均經獻血車金標試紙條快速法初篩合格。每位獻血者留取2管樣本，分別為5 mL的EDTA K2真空采血管(滄州永康)和5 mL的EDTA K2離膠真空采血管(美國BD)，其中不含分離膠的采血管用于ELISA檢測，含有分離膠的用于NAT檢測。NAT管在采集后4 h內離心，各項檢測及拆分鑒別實驗在標本采集后72 h內完成。ELISA HBsAg檢測為：初檢儀器，Tecan公司FreedomEVO前加樣系統，西門子公司BEPⅢ酶免后處理系統。復檢儀器：Tecan公司FreedomEVO前加樣系統，Ausbio公司FAME24/20酶免后處理系統。試劑：乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒(酶聯免疫法)，生產廠家分別為：北京萬泰生物藥業股份有限公司(以下簡稱北京萬泰)，批號：B20161030、B20170628、B20180517、B20180831；英科新創(廈門)科技股份有限公司(以下簡稱廈門新創)，批號：2016115132、2017095126、2018065121、2018085128。質控品：北京康徹思坦公司生產的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)血清(液體)標準物質。NAT檢測為：儀器，羅氏COBAS201核酸檢測系統(美國Roche)；試劑：羅氏公司乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人類免疫缺陷病毒(1+2型)檢核酸試劑(PCR-熒光法)(Procleix UltrioAssay)。質控品：北京康徹思坦公司生產的適用于羅氏二代混檢系統的血篩核酸混合(HBVDNA/HCVRNA/HIV -1RNA)(液體)標準物質。以上所有使用的試劑均檢查合格且在試劑有效期內使用；所有的儀器均按儀器說明書的要求進行保養和維護，并確保儀器在正常工作狀態下運行。

1.2方法 (1)ELISA HBsAg檢測：將樣本管按要求進行離心，ELISA試劑、質控品平衡至室溫。用兩臺FreedomEVO前加樣系統使用一次性加樣針進行全自動加樣，再分別采用BEPⅢ酶免后處理系統和FAME24/20酶免后處理系統進行后續處理。即ELISA兩種試劑使用不同的加樣系統，不同的分析系統同時檢測，按各試劑的檢測標準操作規程進行操作。ELISA兩種試劑均無反應性的樣本判定為HBsAg陰性，兩種試劑均有反應性的樣本判定為HBsAg陽性；只有單一種ELISA試劑有反應性的樣本需進行原試劑雙孔復試，復試雙孔中有一孔或雙孔有反應性的樣本判定為HBsAg陽性，否則判定為HBsAg陰性。(2)單人份核酸檢測：酶免檢測完成后，對照檢測結果挑選并剔除酶免為陽性結果的核酸樣本之后其余樣本做核酸檢測。將核酸檢測試劑、質控品按要求平衡至室溫。將含有EDTAK2分離膠的真空采血管按要求進行離心，使用羅氏COBAS201系統，羅氏核酸檢測試劑進行6混樣模式檢測，混檢有反應性的pool再次進行單管拆分鑒別檢測，確定有反應的是哪個樣本管及HIV1RNA、HCVRNA、HBV DNA具體的反應性項目。無反應性的標本為NAT陰性，有反應性的標本為NAT陽性。 (3)觀察指標：(1)比較NAT與ELISA的HBsAg檢測結果。(2)比較NAT(+)、HBsAg(+)和NAT(-)、HBsAg(+)樣本試劑分布情況。(3)統計10份NAT(+)HBsAg單試劑陽性樣本中北京萬泰試劑與廈門新創試劑S/CO并對比。

2 結 果

2.1NAT與ELISA的HBsAg檢測結果對比 在120份樣本NAT與 ELISA HBsAg 檢測結果中，NAT檢測與ELISA檢測一致，其中NAT檢測NAT(+)17份，包括：ELISA HBsAg(+)10份、(-)7份，ELISA檢測HBsAg(+)17份，包括：NAT(+)10份、NAT(-)樣本7份。見表1。

表1 NAT與ELISA的HBsAg檢測結果對比[n=120，n(%)]

2.2NAT(+)、HBsAg(+)和NAT(-)、HBsAg(+)樣本試劑分布情況與S/CO比對結果 北京萬泰單一ELISA試劑陽性數更高，在ELISA HBsAgS/CO上與廈門新創相比差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 NAT(+)、HBsAg(+)和NAT(-)、HBsAg(+)樣本試劑分布情況

表3 單試劑陽性樣本中北京萬泰試劑與廈門新創試劑S/CO比對結果

3 討 論

NAT在我國采供血機構中仍處于起步階段，但在血液篩查中的應用具有重要意義[5]。相比臨床而言，對試劑靈敏度的要求更高，因采供血機構的檢測目的是為了獲得安全的血液，主要強調的是試劑的靈敏度和特異性，并且對實驗室的規范操作要求更高[6-7]。NAT是一系列直接檢測病毒核酸技術的總稱[8]。主要原理是使用一些物理、化學和生物學方法，通過靶位核酸直接擴增或擴增其附帶信號的方法，讓看不見的極微量的核酸變成直觀的光電和可視信號，從而判斷標本中是否存在相應的病原體[9-10]。

s本次研究結果表明，在120份樣本NAT與 ELISA HBsAg檢測結果中，NAT檢測與ELISA檢測一致，其中NAT檢測NAT(+)17份，包括：ELISA HBsAg(+)10份、(-)7份，ELISA檢測HBsAg(+)17份，包括：NAT(+)10份、NAT(-)樣本7份。在 HBsAg(-)的血液中檢出 HBV-DNA(+)，說明血液存在著 HBV-DNA 在復制，病人輸入這樣的血液后有感染HBV的風險。NAT檢測可以檢出處在HBsAg感染的窗口期、隱匿性HBV感染、HBV變異等導致HBsAg表達抑制，或結構改變等因素使HBsAg不能被檢出，但HBV-DNA在呈低水平的復制血液。7份HBsAg(+)NAT(-)的樣本由于沒有進行中和試驗等其它確證試驗，存在HBsAg假陽性的可能，也有可能是血液中存在的HBV DNA含量在核酸檢測靈敏度之下而造成結果陰性，或機體的長期病毒感染導致血液中抗原滴度很高，不影響HBsAg的檢出，但血液中存在的HBsAg是由病毒DNA整合到人染色體與宿主基因共同表達所致，所以檢測不到血清中病毒HBV-DNA。北京萬泰單一ELISA試劑陽性數更高，在ELISA HBsAgS/CO上與廈門新創相比存在顯著差異，說明兩者的靈敏度有差異。另外北京萬泰試劑和廈門新創試劑在HBsAg亞型及變異HBsAg的檢測中，北京萬泰試劑對HBV亞型最低檢出量的檢出能力強、靈敏度高，兩種試劑在adradway亞型的最低檢出量有顯著性差異。

綜上所述，NAT方法和ELISA方法在HBV感染標志物的檢測結果中有明顯的差別，單獨使用兩種方法中的一種存在著漏檢的可能。核酸檢測在一定程度上可以彌補ELISA的漏檢情況。兩種HBsAg檢測試劑中北京萬泰試劑與廈門新創試劑之間存在著差異，北京萬泰HBsAg試劑檢出率明顯高于廈門新創HBsAg試劑。