類風濕性關節炎間質性肺疾病動物模型概述

敖琴 李龍△ 劉俊 李俊媛 李培霆

(1.貴州醫科大學附屬醫院風濕免疫科，貴州 貴陽 550004；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院感染科，湖北 武漢 430022)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病因不明的慢性自身免疫性疾病，病變主要位于四肢小關節，隨著疾病發展，可累及全身各個系統，其中ILD是最常見的關節外改變。RA患者中有2%～10%可發展為類風濕性關節炎間質性肺疾病(rheumatoid arthritis- interstitial lung disease ,RA-ILD)[1]；近年來RA的總體死亡率有所下降，但ILD卻成為RA患者主要死亡原因之一，并呈逐年上升趨勢，占所有RA相關死亡的7-13%[2]。RA-ILD表現為肺部不同程度的炎癥和纖維化活動，該過程被認為是漸進的，并在很大程度上不可逆轉，其中常見的病理類型為普通間質性肺炎(usual interstitial pneumonia,UIP)和非特異間質性肺炎(non-specific interstitial pneumonia,NSIP)，而UIP在RA-ILD中最常見，表現為明顯的致密纖維化和肺結構重塑[3]。目前多數觀點認為，ILD是由遺傳和環境因素共同造成，但具體病因和發病機制尚不清楚；臨床上大多數患者在肺部出現明顯癥狀、肺功能顯著受損后才被明確診斷，這對于RA-ILD的早期識別及延緩疾病進展是一項艱巨的挑戰[4]。要想進一步深入研究，選擇合適的動物模型是實驗進展的關鍵步驟。而UIP作為RA-ILD中最常見的病理類型，所以在造模過程中，通常參考UIP動物模型的造模方法。報告如下。

1 博來霉素誘導

博來霉素(bleomycin,BLM)為鏈霉菌中提取出來的一種細胞毒性藥物，在臨床上被作為抗腫瘤藥物使用，因其副作用可導致肺纖維化，所以在研究類風濕性關節炎相關間質性肺疾病發病機制方面，常采用BLM誘導的肺纖維化動物模型[5]。BLM的給藥方式包括氣管內給藥、霧化、尾靜脈注射、腹腔注射等，目前常用的方法為氣管內給藥[6-7]。有研究比較了氣管內灌注和Penncentur動物霧化器氣管內霧化兩種方法結果顯示，Penncentur霧化器氣管內霧化造成的小鼠肺纖維化病灶分布更均勻，而且可降低繼發感染的風險，但與傳統口鼻暴露霧化吸入相比，Penncentur氣管內霧化操作復雜，費用較高[8]。而對于BLM的使用劑量，根據所選動物類型、藥物使用方式的不同，在劑量上的運用也存在著顯著差異，目前國內尚無確切的標準。BLM誘導的肺纖維化動物模型早期表現為間質性炎癥和血管損傷，晚期以肺間質纖維化形成為特點[9]。王鶴、Mahmutovic Persson等[10-11]均使用SD大鼠作為模型，通過連續氣管內灌注BLM的第3天，支氣管肺泡灌洗液的總蛋白量、炎性細胞以及血漿滲出量開始增加，肺組織Masson染色顯示肺間質開始出現紅細胞和部分炎細胞的浸潤，磁共振檢查肺部也出現了肺總體積增加；而在之后的第7、21、28天炎癥有所緩解，小鼠肺間隔呈中、重度增厚，肺泡結構消失，成纖維細胞及膠原基質的沉積顯著。 周平[12]也采用SD大鼠器官灌注BLM，在連續給藥的第7天小鼠肺組織HE染色后表現為急性炎癥損害病灶，第14天后炎癥有所緩解，但出現成纖維細胞的增生、肺泡結構破壞，第28天肺泡破壞嚴重，肺泡間隔大量膠原和纖維蛋白沉積。以上BLM誘導的病變主要集中在肺組織，其他器官暫未出現損傷表現。通過BLM誘導的間質性肺疾病，技術成熟，造模周期短，形成的間質性肺部疾病相對穩定；然而與RA-ILD的不可逆性、緩慢進展性以及形成背景的特點相比，該方法雖具有強大的可重復性和通用性，但其本身仍不能確切的復制出RA-ILD，在還原其病理變化上仍有所不足[13]。

2 膠原誘導性關節炎模型

膠原誘導關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)是目前最常用的類風濕性關節炎動物模型誘導方法，在很大程度上能復制出RA的病理狀態，且造模成功率較高，但在疾病模型的誘導中，關節外的病變研究相對較少，以常見的肺間質疾病為例，只有少部分研究描述了在膠原誘導關節炎的前提下，可發生肺部炎癥的變化。高波、Y.Terasaki[14-15]在利用CIA造模過程中，選擇恢復期小鼠提取肺組織染色發現肺部外周血存在大量正球形、著色較深的外周血淋巴細胞以及大量紅細胞，同時肺泡結構出現破壞，肺間隔增厚，毛細血管出現擴張，且TNFα、IL-6、IL-β的表達均明顯上升，結果具有統計學意義。E.Schurgers等[16]利用γ干擾素受體敲除小鼠在CIA的誘導下，于免疫后的第21天小鼠肺表面發現有巨噬細胞和中性粒細胞組成白色半透明斑塊，并且在血管周圍和細支氣管周圍出現大量淋巴細胞的浸潤，肺間質也含有類似于風濕結節的肉芽組織樣結構浸潤。之后Tomomi Sato[17]發現在首次免疫后的第7天，CIA小鼠胸膜下區開始出現炎性細胞的聚集，抗CCP抗體也在血清中被檢測到；免疫后第49天肺HE染色發現肺周圍，尤其胸膜下區域，炎癥細胞呈片狀間質浸潤，其中以M2表型的CD11b巨噬細胞增多為主，該表性的巨噬細胞可促進纖維化的發生；此外還有IgG和補體C3沉積、抗瓜氨酸纖維蛋白抗體(ACPAs)產生，但之后該肺部表現逐漸減弱，免疫后第105天和161天額外免疫也未出現膠原沉積，也未顯示明顯的纖維化跡象，第182天肺組織的炎性改變及膠原沉積不再被觀察到。通過CIA誘導的RA-ILD模型，雖然目前有關研究較少，但根據CIA小鼠肺部炎癥細胞的浸潤部位、補體和ACPAs滴度增高等表現來看，這種模型與人類RA-ILD明顯相似。只是目前認為CIA所導致的小鼠肺改變是可逆的，沒有進一步纖維化的跡象[18]。因此CIA模型造成肺部炎癥變化或許可作為RA-ILD早期發病機制研究模型建立基礎。

3 腫瘤壞死因子轉基因誘導模型

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是RA和肺疾病持續進展的關鍵細胞因子[19]。Cazlaris H等[20]曾在以C57BL/6CBA為背景下，獲得了腫瘤壞死因子轉基因(tumor necrosis factor transgenic,TNF-TG)小鼠，該過程為通過一個包含編碼整個人類TNF-α基因片段的靶向載體，其中含有ARE的3‘UTR被來自β-珠蛋白基因的3’UTR取代，植入這種靶向載體后，可增加TNF-α基因的穩定性和翻譯效率，從而通過全身過表達TNG-α，導致炎性侵襲性關節炎。有學者發現在TNF-TG小鼠模型中，除有典型的關節炎病變外，還存在著ILD，并且表現為慢性、漸進性改變，與人RA-ILD更為相似[21-22]。Richard D.Bell等[23]曾利用TNF-TG小鼠誘導出ILD，并采用肺微型計算機斷層掃描(MCT)小鼠肺組織，結果顯示TNF-TG小鼠在所有時間點的組織體積、總肺體積和平均強度都顯著增高。此外Emily K.Wu等[24]同樣曾利用TNF-TG小鼠誘導ILD，與正常對照組比較后提示TNG-TG小鼠的氣體交換能力受損，呼吸阻力增加，吸氣量顯著降低，肺順應性、彈性也均降低。然而該實驗沒在病變肺組織發現膠原沉積的改變，但在肺間質組織中存在明顯的炎性細胞聚集。與人RA-ILD的肺纖維化改變相比，TNF-TG模型雖不能完全描述臨床疾病的所有方面，但可用來闡釋TNF驅動的炎癥和間質性肺疾病間的關系。

4 其 他

除上述方法外，FU Yalu等[25]在CIA模型全身免疫反應的基礎上聯合BLM誘導小鼠間質性肺疾病，該模型呈現出全身慢性炎癥反應進行性肺纖維化持續加重的病理，與RA-ILD的臨床表現更為接近。而SKG小鼠，因編碼ZAP-70 SH2結構域的基因突變，可自發發生T細胞介導的慢性自身免疫性關節炎，通過腹腔注射酵母多糖的SKG小鼠可因自我耐受的破壞引起關節癥狀和ILD，因此亦可通過上述方法在該類型小鼠中研究自身免疫性關節炎背景下引起的ILD[26]。此外，也有利用基因工程手段來建立肺纖維化模型的研究，L.William E等[27]利用表面活性蛋白C(SFTPC)、表面活性蛋白-A2 (SFTPA2)、端粒酶逆轉錄酶(TERT)和端粒酶RNA(TERC)這四個基因來構建轉基因小鼠，再運用四環素誘導這些基因的表達系統的啟動或關閉，從而構建肺纖維化小鼠動物模型。

5 展 望

目前國內無論在研究RA-ILD還是其他原因所導致的肺間質纖維化，通常為單獨復制肺部病變的模型，如BLM誘導的肺纖維化模型仍然是最常用且相對成熟的方法，但值得注意的是與人RA-ILD相比，該病變只局限在肺組織，并未引起關節受損。CIA和TNF-TG小鼠誘導的模型可兼并關節炎和間質性肺疾病兩種疾病狀態，這更加接近人RA-ILD的病理改變，而且更符合RA-ILD早期發病是在炎性自身免疫條件下發生的機制特點。但不足之處在于上述模型的肺部病變程度普遍較輕，且通常為可逆性改變。因此，要想獲得構建相對簡易且經濟、全面反映人RA-ILD特征的動物模型，仍是亟需不斷深入研究的內容之一。