高通量測序檢測流產組織染色體異常對治療復發性流產的意義

何建萍 唐健 錢源,2 秦茂華 羅勝軍 呂夢欣△

(1.昆明市婦幼保健院醫學遺傳與產前診斷科，云南 昆明 650031；2.昆明醫科大學第一附屬醫院云南省檢驗醫學重點實驗室，云南 昆明 650032)

流產指胚胎或胎兒在著床后20周內自發丟失，據報道顯示10%～15%的妊娠會發生流產[1]。其中大多數流產發生在妊娠的前三個月(未滿13周)，復發性流產被定義為兩次或兩次以上的妊娠丟失，3%～5%的妊娠夫婦會發生[2]。 復發性流產由很多因素造成的，有些來源于母體原因，例如TORCH感染，甲狀腺功能減退，子宮異常等；有些因素是胎兒和母親之間免疫反應的結果[3]。復發性流產最常見的胎兒原因是染色體異常，在第一胎的比例占到50%[4]。傳統的染色體分析方法是進行外周血染色體核型分析，其主要限制因素包括對活體組織的需求、培養不合格(約10%～40%)、母細胞污染以及分辨率有限(通常低于5～10 Mb)等[5]。高通量測序技術分析用于檢測整個基因組中的拷貝數變異(CNV)，分辨率低至10kb。通過高通量測序技術檢測羊水標本的染色體非整倍體和基因拷貝數的靈敏度和特異性均為100%[6]。本文通過高通量測序技術對復發性流產組織進行檢測，分析染色體異常對胎兒復發性流產的影響，對夫婦再次妊娠進行指導。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年5月至2019年5月在昆明市婦幼保健院及協作醫院產科門診的復發性流產絨毛組織(流產次數≥2次)，共207例，患者年齡介于20～44歲，平均31歲，胚胎停育孕周介于6～9周，召回69對夫婦進行常規外周血染色體核型分析，均詢問接觸史、孕產史和家族史。所有患者均充分知情并簽署知情同意書。

1.2方法 (1)高通量測序技術檢測:自2017年5月至2019年5月共對207例流產組織進行高通量測序技術檢測。將胎兒絨毛組織用生理鹽水清洗3～5次，通過DNA提取試劑盒(QIAamp 試劑盒，51306)提取DNA后構建文庫，質檢合格后上機測序(Life Tech，DA8600)進行數據分析和解讀。(2)夫婦染色體外周血染色體核型分析:經知情同意對召回的69對夫婦進行常規外周血染色體G顯帶核型分析，將外周血接種于細胞培養基(廣州白云山拜迪生物醫藥)，培養72小時后進行細胞收獲，離心3000轉5 min，經低滲、固定、滴片、烤片、顯色、染色、分帶后使用全自動核型分析系統(美國萊卡，GSL-120)掃描分析20個圖像。

2 結 果

2.1高通量測序技術檢測結果 在檢測的207例流產組織中，檢測結果未見異常為93例，占44.9%；片段缺失或重復為23例，占11.1%；X單體和16三體均為18例，均占總體的8.7%；22三體為12例，所占比例為5.8%。另外三倍體和XY/XX嵌合分別為8和7例。見表1。

表1 流產組織高通量測序檢測結果[n，207例]

2.2高通量測序檢測陽性比 207例流產組織中檢出染色體異常例數為114例，所占比例55.1%，包括58例染色體三體，約占異常類型結果的50.9%；18例X染色體單體，約占異常結果的15.8%；23例片段缺失或重復的染色體，約占異常結果的20.2%；8例三倍體，約占異常結果的7.0%；7例XX/XY嵌合體，約占異常結果的6.1%(見圖1A)。圖1B示為一例13q11-q34存在約95.76M片段重復和19p12存在約0.32M片段重復的患者高通量檢測結果。13號染色體三體，也稱為Patau綜合征，絕大多數會發生自然流產。

2.3親本染色體核型結果分析 共召回69對夫婦進行外周血染色體核型檢測。69例復發性流產組織高通量測序結果中49例未見異常，親本核型檢測結果均為未見異常，但其中其中不明家族史1例，少精癥3例，子宮發育異常1例；高通量結果為片段缺失/重復者共8例，對應親本檢測結果3對為未見異常，6對夫婦中均有一方為平衡易位，其中1例精子活力弱；高通量測序結果為三體者有9例，親本檢測結果未見異常7例，1例平衡易位，1例小Y；通量結果為X單體者2例，親本檢測結果均未見異常；高通量結果為三倍體1例，夫妻雙方檢測結果均為9號臂間倒位。

注：A.207例流產組織中染色體異常檢出情況；B.高通量測序技術檢出染色體微重復及重復所在具體區域。圖1 流產組織高通量測序檢測異常結果

2.4年齡與高通量測序結果的相關性分析 在207例受檢者中，年齡大于35歲組胎兒染色體異常陽性率為65.52%(38/58)，低于35歲組胎兒染色體異常陽性率為50.34%(75/149)，通過分析發現不同年齡組胎兒染色體異常陽性率，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 年齡與高通量結果的相關性分析[n(%)]

3 討 論

復發性流產可能源于多種因素，如遺傳因素或母體結構異常因素、感染因素、免疫因素，以及其他未知因素[7]。本研究對207例復發性流產組織進行檢測并分析，其中染色體異常類型共檢出114例，包括58例染色體三體，18例X染色體單體，8例三倍體，7例46,XX/46,XY嵌合體，23例片段缺失或重復的染色體；染色體異常檢出率為55.1%，染色體異常率與相關報道一致[8-9]。上述結果提示染色體異常是導致復發性流產的重要原因。

胎兒染色體非整倍體(胎兒染色體三體或單體或胎兒常染色體異常)是遺傳因素中導致早期反復妊娠丟失的最常見原因，這些異常在所有人類生育的常見問題至少占5%[10]。三體多為偶發性，非遺傳性，可能為減數分裂I期染色體的異常配對和分配將形成非整倍體的配子，這種類型通常在妊娠8周之前終止[11]。本次研究顯示染色體三體共檢出58例，約占異常結果50.9%，其中16三體所占比例最高，其次是22三體。X單體是人類唯一能生存的單體綜合征，患者第二性征發育不全且伴有原發性閉經[12]。45，X0是最多見的一型且具有較為典型的臨床表現。本此研究檢出18例X染色體單體，約占15.8%。此類異常發生主要為偶發性、非遺傳性，此類檢出者再次妊娠時應建議孕婦進行產前診斷。

本研究檢出三倍體8例，陽性率為3.9%。據報道三倍體大約發生于2%的妊娠，是早孕期自然流產中常見的染色體畸變，其形成原因為雙精受精或雙雌受精[13]。檢出46,XX/46,XY嵌合體7例，約占異常結果6.1%。據文獻報道，發生人類異源嵌合體大致有三種機制：第一種是2個胚胎融合；第二種機制是卵子和第二極體雙受精；第三種機制是單個卵子經孤雌分裂產生2個DNA相同的單倍體的配子雙受精，融合發育成的個體[14]。對此異常發生者進行充分遺傳咨詢，告知夫妻備孕時應避免接觸可能導致染色體畸變的因素。

傳統染色體異常的分子檢測方法主要針對特定染色體序列或片段，由最初檢測大突變到后續檢測小突變，如FISH、QF-PCR等檢測技術。隨著下一代測序(NGS)技術的發展，所有患者或攜帶者的變異類型的綜合突變篩選都可以在一個平臺上進行。與常規染色體核型分析相比，高通量測序技術可以直接從胎兒細胞中純化的DNA進行，無需細胞培養，因此可以更快地獲得結果而且可以減少細胞培養失敗的風險[15]。此外，高通量測序技術可以檢出常規染色體核型分析無法識別的微缺失微重復，并可以對重復區域的片段給出準確的信息，協助臨床進行診斷、咨詢。本文中檢出片段缺失或重復的染色體23例，約占異常結果20.2%；推測親本存在染色體異常可能(如染色體平衡易位)，建議對夫婦雙方進行外周血染色體檢測或高通量測序。對親本存在染色體異常的夫婦進行充分的遺傳咨詢，對有相關指征者可建議夫婦行試管嬰兒技術。

本文研究結果顯示孕婦不同年齡段復發性流產組織中染色體異常檢出存在一定的統計學差異，如表2所示，結論與文獻報道一致[16]。本文檢測69對親本外周血檢測染色體異常共計9對，染色體異常攜帶率約占13%，本結果提示遺傳因素導致胎兒染色體異常是發生復發性流產的重要原因，但本文親本染色體異常攜帶率高于文獻報道[17]，推測樣本量大小對結果存在一定影響。

總言之，染色體異常仍然是流產的主要原因。通過使用高通量測序技術可以更快速，準確、全面地檢出復發性流產組織染色體異常情況，為臨床遺傳咨詢提供有力支持，為夫婦繼續妊娠提供有效指導。