紅細胞低溫保存中海藻糖的加載方法

劉寶林，趙子威

（1.上海理工大學 健康科學與工程學院，上海 200093；2.上海理工大學 能源與動力工程學院，上海 200093）

紅細胞是血液的重要組成部分，是必不可少的醫(yī)療及軍需物資。目前，紅細胞的常規(guī)保存方法是在（4±2）℃下冷藏保存，此方法最多保存5～7 周[1-2]，無法長期大量儲存，僅用于滿足各大血庫的臨時輸血需求。因此，人紅細胞長期保存是目前輸血醫(yī)學領域的重點研究方向。

生物材料在低溫條件下可進行長期保存已被廣泛熟知，紅細胞的長期保存方案分為冷凍保存和凍干保存兩種，而這兩種方法都需要加入低溫保護劑(CPA)來減少細胞在降溫過程中受到的損傷。早在1950 年，甘油(glycerol)就被發(fā)現能夠作為紅細胞的低溫保護劑并成功將其冷凍保存[3-4]。1972 年，Meryman 等[5]優(yōu)化了紅細胞的保護劑配方，包含6.2 M 甘油、0.14 M 乳酸鈉、5 mM 氯化鉀和5 mM 磷酸二氫鈉，冷凍保存1 年后，紅細胞恢復率可達80%～90%，該配方簡單高效，人們在此基礎上不斷改良。

然而，甘油的毒性一直是個無法避免的話題，研究表明高濃度的甘油會造成卵母細胞DNA 甲基化的改變[6]，影響精子的活性[7]，也會造成紅細胞的溶血或變形[8]等影響。所以，在臨床輸血前，必須對解凍的紅細胞進行漫長且復雜的洗脫甘油過程[9]，這一過程不僅費時費力，也往往會損失約15%的紅細胞[10]。因此，紅細胞保護劑的“無甘油化”顯得尤為重要，找到一種具有生物相容性的低溫保護劑并優(yōu)化保存方法，不需要繁瑣的加載、洗滌過程，能夠在短時間內獲得高質量的血液，是目前紅細胞保存領域的發(fā)展趨勢。

其中，海藻糖(trehalose)就是一種無毒、保護效果好的生物相容性保護劑[11]，在細胞處于冷凍、干燥、熱休克、氧化和高滲透壓等環(huán)境時能夠起到較好的保護效果[12-13]。海藻糖作為一種非滲透性保護劑，正常情況下對紅細胞膜的滲透性非常低，但只有當海藻糖進入細胞時才能起到最大限度的保護效果[14-15]。所以，如何將海藻糖成功加載至紅細胞內是一個關鍵問題，許多學者也通過各種手段解決這一問題。本文就紅細胞保存面臨的保護劑毒性問題，分析了海藻糖的保護機理和應用領域，著重介紹了目前海藻糖進入紅細胞的加載方案，對未來紅細胞的低溫保存進行了展望。

1 海藻糖與紅細胞低溫保存

海藻糖是一種天然的非還原性雙糖，由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基結合而成，廣泛分布于細菌、真菌和動植物的體內，由于其抗低溫、耐干燥和穩(wěn)定的化學性質，作為保護劑被應用于各種生物材料的低溫保存[16-19]。研究顯示，在對人體注射高達30 g 海藻糖后的一個小時內，各項生理指標均正常，身體無明顯不良反應[20]，充分說明海藻糖作為一種生物相容性保護劑值得被關注。

1.1 海藻糖的保護機理

海藻糖對維持細胞膜的穩(wěn)定早有定論，但對其保護機理的研究還停留在探索層面，目前主要存在“水替代”和“玻璃化”2 種假說。

a.水替代假說。

冷凍、干燥狀態(tài)下，海藻糖可以代替水分子與細胞膜和蛋白質上的親水基團形成水合鍵，避免細胞膜和蛋白質分子結構改變，保持其結構和功能的穩(wěn)定[21]，而細胞膜物理狀態(tài)的改變和蛋白質的變性是造成細胞死亡的直接原因[22]。李文慧等[23]發(fā)現海藻糖的負載濃度與凍干紅細胞后的殘余含水量呈負相關，且殘余水分布只在細胞膜中，進一步證實了此假說的正確性。

b.玻璃化假說。

2009年底，魏銀倉成立珠海銀通新能源有限公司（下稱“銀通”），即銀隆的前身。魏銀倉踩準了政策的節(jié)奏：2009年正是中國新能源汽車產業(yè)拉開序幕的一年，政府從當年起大力扶持新能源汽車產業(yè)。至2013年，中央財政和地方政府陸續(xù)頒布政策，按照補貼標準，一輛長度在6～8米的電動中巴車，可獲得補貼共計60萬元。在高額補貼刺激下，中國新能源汽車產銷量開始猛增，并在2015年成為全球最大的新能源汽車市場。

高濃度海藻糖可以提高細胞懸液的玻璃化轉變溫度[24]，而玻璃態(tài)的高黏度性質能夠降低分子之間作用力，更容易形成這種穩(wěn)定的狀態(tài)，減少細胞在降溫過程中受到的冰晶損傷。Liu 等[25]發(fā)現在降溫過程中，海藻糖能抑制溶液共晶的形成，而共晶往往與低溫細胞的低溫損傷有關，且隨著海藻糖濃度的提高，溶液玻璃化轉變溫度也升高。

探索海藻糖對紅細胞的保護機理，不僅需要實驗層面的觀察，也需結合分子動力學對其微觀機理進行深入探究，如Kumar 等[26]通過分子動力學模擬分析了海藻糖與磷脂雙分子層的相互作用機理，成功證實了以上兩種假說。實現紅細胞的高質量保存也不能只關注細胞膜完整性，同樣要關注其變形程度、攜氧功能等更多特異性指標。

1.2 海藻糖在紅細胞保存中的應用

將海藻糖應用于紅細胞低溫保存主要有冷凍保存和凍干保存兩種方法。冷凍保存是目前臨床上低溫保存紅細胞最常用的方法，大多使用甘油或二甲基亞砜作為冷凍保護劑，但它們對紅細胞的毒性問題也導致凍存結束后需要花費大量時間洗滌去除，這一過程紅細胞損失較大。因此，無毒無害的海藻糖有望在未來取代甘油成為紅細胞保存主要的保護劑。冷凍保存由于其特定的保存條件（-196℃液氮或-80℃冰箱），往往需要額外的保存成本和占地空間，也難以在特殊的環(huán)境下（長途運輸或戰(zhàn)爭期間）保證使用條件。因此，保存溫度限制小、運輸方便、成本更低的凍干保存逐漸被研究者重視起來[27]。但由于凍干保存相對較低的紅細胞和血紅蛋白恢復率，及復水后的紅細胞活性問題，一直無法真正應用于臨床，若這種技術能夠獲得突破，將具有十分廣泛的應用前景。

2 海藻糖的加載方法

由于海藻糖對細胞膜的不可滲透性[28]，研究者們嘗試使用各種方法將海藻糖載入哺乳動物細胞。包括修改基因表達法[29]、蛋白成孔法[30]、顯微注射法[31]、液相內吞法[32]等，以實現成纖維細胞、角質細胞、卵母細胞和血小板等有核細胞的海藻糖加載。而成熟的紅細胞由于缺少細胞核且體積較小，無法應用以上技術。因此，本文列舉一系列將海藻糖加載至紅細胞，并最終成功實現冷凍保存或凍干保存的方法。

2.1 孵育法

當紅細胞長時間置于高濃度海藻糖、高溫度環(huán)境時，細胞膜會發(fā)生滲透失衡和磷脂相變，使得胞外海藻糖進入胞內。孵育法是最早出現，也是操作最簡單的方法，Satpathy 等[33]將紅細胞置于含有海藻糖的磷酸緩沖溶液中，以觀察加載效率與胞外海藻糖濃度、加載時間與加載溫度之間的關系。研究發(fā)現最佳的孵育條件為胞外海藻糖濃度800 mM，在37℃下孵育7 h，胞內海藻糖濃度可達40 mM，不過由于紅細胞長期暴露在高滲溶液中，也導致細胞形態(tài)出現異常。在何暉等[34]的研究中，該方法使凍干恢復率最高達53.6%，較未孵育海藻糖提高了22%。Wolkers 等[32]曾將此方法應用于血小板的凍干保存中，卻發(fā)現胞外海藻糖濃度35 mM 是血小板最佳的孵育環(huán)境；而在Satpathy 的實驗中，胞外海藻糖濃度在超過600 mM才會顯著提升加載效率。這也進一步說明，紅細胞不同于有核的血小板以胞吞的方式加載海藻糖，只能通過細胞內外巨大的滲透壓差提供加載動力。

2.2 滲透休克法

滲透休克法是對細胞內外滲透壓差進行控制，刺激細胞膜上通道開啟與閉合，從而促進海藻糖載入細胞內的速度和數量。Zhou 等[35]將紅細胞先后置于高滲葡萄糖溶液（28%w/v）中失水皺縮、低滲海藻糖溶液（4%w/v）中吸水重脹，在此過程中，借助紅細胞內外的滲透壓梯度變化促進了海藻糖的加載。相較于單一步驟的孵育法，整個過程加載時間大幅縮短，僅需50 min，胞內海藻糖濃度可達43.2 mM，凍干后紅細胞恢復率由對照組的31.6%提升至53.6%，形態(tài)學和生化指標良好。但正是因為過程中膜上通道的開放，也導致胞內一些物質（如血紅蛋白）的泄露，紅細胞質量略有下降。

滲透休克法的操作流程比較復雜，需要多次離心洗滌，人工操作量大、紅細胞浪費嚴重。Shen 等[36]將此方法與微流控技術相結合，充分利用微流控芯片精準化、自動化、標準化的特點，以一種更自動、高效的方法加載海藻糖。在該研究中，紅細胞懸液在微流控芯片中先后流經低滲包載區(qū)、高滲封裝區(qū)和膜交換區(qū)。紅細胞在低滲海藻糖溶液中吸水膨脹，細胞膜上開孔，海藻糖滲入胞內；在高滲海藻糖溶液中失水皺縮，恢復等滲狀態(tài)，并封閉開孔；接著在等滲氯化鈉溶液中清除多余的游離血紅蛋白、細胞碎片；最后經芯片出口流出，以達到海藻糖的自動加載效果。這種方法在2 min 內即可達到21 mM 的海藻糖負載量，但由于芯片體積的限制，不足的海藻糖負載量在冷凍和凍干實驗中，并沒有得到理想的細胞恢復率，若能進一步控制海藻糖在芯片內的流速或開發(fā)更大體積的芯片，或許能有更好的效果。

2.3 脂質體法

脂質體法通過人工合成一種包裹著海藻糖的雙層脂質體微囊，脂質體膜與細胞膜結構相似，具有可相容性，因此與細胞一同培育，可將海藻糖遞送至細胞內。該方法也被廣泛用于生物學、醫(yī)學等領域，以將各種藥物和小分子物質加載至哺乳動物細胞內。Holovati 等[37]用二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)，和膽固醇合成了這種脂質體微囊，不僅成功將海藻糖加載至紅細胞內，冷凍存活率由29%提升至66%，且顯著改善了凍融結束后細胞膜的完整性。

2.4 聚合物法

由Lynch 團隊合成的一種基于pH 響應的聚合物PP-50 目前為止能使海藻糖的載入量達到最高[40-41]，該聚合物主鏈為聚L-賴氨酸間苯二甲酰胺(PLP)，側鏈的羧基被L-苯丙氨酸取代。當環(huán)境處于低pH 時，PP-50 能夠向疏水性結構變化，以增強與磷脂雙分子層的相互作用，實現了細胞膜的可滲透性[42]。在對人紅細胞的凍干實驗中[41]，最高能將251 mM 的海藻糖載入胞內，也使細胞膜完整性較對照組提高了9 倍，改善血紅蛋白的被氧化程度，極大地促進了海藻糖的保護效果，冷凍存活率由62.2%提高到86.6%，但此方法長時間的孵育時間也會導致溶血的發(fā)生。所以，可以在保證保護效果的前提下，適當降低海藻糖的載入量，以找到最佳的孵育條件。此外，聚合物的復雜制備工藝與洗滌環(huán)節(jié)也限制了該方法的臨床使用，且低pH 環(huán)境及聚合物本身對紅細胞的影響仍有待研究。Zhang 等[43]也嘗試對γ-聚谷氨酸的側鏈進行接枝以制備另一種聚合物，其保護機理與PP-50 增加海藻糖對細胞膜可滲透性類似，但海藻糖載入量卻遠低于PP-50 的表現。

2.5 電穿孔法

電穿孔法主要通過對細胞懸液施加短時間的電場脈沖來增大細胞膜的滲透性。當細胞膜處于外加電場時，膜兩邊的電解質離子會發(fā)生極化，導致膜內外形成電位差，進而擊穿細胞膜形成小孔，且離子在膜上運動產生的局部焦耳熱也進一步增強了孔的形成，胞外物質得以進入細胞內。而當電場脈沖消失后，小孔在細胞弛豫現象后重新閉合[44]。在實際操作中，可以針對不同細胞，設置不同的電場參數，以達到最佳的載入條件。

Zhou 等[45]研究了胞外海藻糖濃度、電場強度、脈寬和脈沖頻率這4 種因素對海藻糖加載效率的影響，最終發(fā)現當胞外海藻糖濃度為800 mM、電場強度為1.5 kV/cm、脈寬為1 ms、頻率為4 次/min時，細胞可加載63.7 mM 海藻糖，同時紅細胞凍干恢復率達70.9%。但高的恢復率并不意味著高的質量，研究結果表明，使用電穿孔法會造成更為嚴重的溶血，也未進一步檢測細胞膜質量、紅細胞生化活性等指標。有學者認為，這種電穿孔現象會對細胞造成嚴重的不可逆損傷[46]，所以此方法能否得到廣泛應用仍有待考量。

2.6 超聲波法

與電穿孔法類似，超聲波法也是通過外加物理場來改變細胞膜通透性，當細胞周圍充斥著微小氣泡時，超聲波的能量會使微泡振蕩和破裂以誘導細胞膜上形成暫時性的孔隙，同時在孔隙周圍形成擾流，促使胞外物質向胞內傳遞。Centner等[47]首次利用這種“聲孔效應”，往含有海藻糖和紅細胞的緩沖溶液中充入脂質包裹的十氟丁烷微氣泡[48]，在外界超聲的作用下成功將海藻糖加載到紅細胞中，并在冷凍和凍干狀態(tài)下長期保存。Janis 等[49]還將這種“聲孔效應”與自動射流裝置相結合，在流動的紅細胞懸液外部施加超聲波，以一種更高效、均勻的方式完成海藻糖載入過程。結果顯示，自動射流裝置僅需1 min 即可使胞內海藻糖濃度達150 mM，且胞內海藻糖濃度和紅細胞質量隨著微泡數量的增多而提高，同時也不用考慮十氟丁烷這種生物相容物質的濃度對紅細胞的影響。然而在Janis 的實驗中，高效的海藻糖載入雖然得到了較高的冷凍恢復率（約95%），而沒有帶來良好的凍干恢復率（約25%），也缺少其他因素對紅細胞的影響實驗（如細胞流過時設備的溫度、超聲波頻率和壓力、細胞流速和濃度等），超聲對紅細胞是否存在潛在威脅也尚未清楚。

2.7 納米粒子法

利用各種各樣的材料和制備工藝，許多納米粒子已被成功開發(fā)并應用于低溫保存領域。各種研究表明，納米粒子在調節(jié)細胞膜滲透性[50]、改善溶液熱力學性質[51]、強化升降溫速率[52]等環(huán)節(jié)都有著顯著效果，為細胞、組織和器官的凍存開辟了一條新途徑。利用納米粒子調節(jié)細胞膜滲透機制可用于強化海藻糖載入紅細胞，Stefanic 等[53]在磷灰石納米粒子周圍覆蓋帶正電的2-氨基乙基磷酸離子(2-aminoethylphosphate,AEP)及帶負電的六偏磷酸離子(hexametaphosphate,HMP)，以形成具有膠體性質的懸浮液。這種帶電的磷灰石納米顆粒可以通過局部地、可逆地、瞬時地改變磷脂雙分子層的性質，來促進海藻糖的滲透。該納米粒子具有pH 響應機制，在胞外海藻糖濃度為350 mM和37 ℃條件下，pH=6.5 時可載入51 mM 海藻糖進入紅細胞，而pH=7.4 時海藻糖的載入量只有31 mM，且在低pH 環(huán)境下達到91%的紅細胞凍融存活率（相較對照組提高了42%）。該研究還通過熒光顯微觀察到納米粒子只在細胞膜上參與調節(jié)機制，并不會進入紅細胞內造成影響。同時也證明了納米粒子與細胞膜的相互作用并不是通過生成膜孔，而是通過局部修飾磷脂雙分子層的三維結構來增加滲透效果。

本文對這些海藻糖加載方法進行了總結，如表1 所示，不難看出每種方法都各有優(yōu)缺點。筆者認為可以將幾種方法聯合使用，例如在電穿孔時考慮加入脂質體以修復細胞膜受到的損傷，也同時保證了高效的海藻糖載入量。

表1 紅細胞中海藻糖加載方法對比Tab.1 Comparison of loading methods of trehalose in RBC

3 海藻糖加載的安全問題

海藻糖加載量是發(fā)揮其保護效果的根本前提，一般來說胞內海藻糖濃度達到50 mM 才有較好的保護效果[40]，低濃度加載量無法提供足夠的保護，高濃度加載量往往是由于細胞結構被破壞所導致，所以應在保證適當加載量的前提下，最大限度地保護細胞結構不受破壞。需要長時間孵育的加載方案不僅會對紅細胞造成嚴重的滲透損傷，高溫環(huán)境下的細胞并未停止代謝活動，也會進一步影響細胞質量；外加物理場這種刺激性強的加載方案雖然能夠快速地載入足夠濃度海藻糖，但對細胞膜產生的不可逆損傷較大；通過在細胞膜上開孔的方法對海藻糖的加載是非選擇性的，往往導致除海藻糖以外的物質交換，如胞內離子及血紅蛋白的逸出或不必要的胞外物質滲入。高載入量的海藻糖往往犧牲了原始紅細胞為代價，而這一點在許多文獻中都被忽略，從而導致真實紅細胞損失率實際大于文獻中給出的數據。

即使列舉上述多種海藻糖載入方法，但凍干紅細胞所面臨的低恢復率問題仍未得到根本解決，不僅在于保護劑的突破，更重要的是優(yōu)化凍干工藝的創(chuàng)新。因此，從保護劑添加到干燥及復水各個環(huán)節(jié)均需要進一步探索最適合紅細胞保存的獨特工藝，才有希望突破壁壘，實現紅細胞高質量的低溫保存。

4 結 論

本文從海藻糖替代甘油作為紅細胞低溫保護劑的角度出發(fā)，分析了海藻糖在紅細胞低溫保存中的保護機理與應用領域，并對目前海藻糖進入紅細胞的各種方法進行了詳細介紹，最終得出如下結論：

a.應盡量減少紅細胞在海藻糖加載過程中導致的細胞損傷，快速、溫和、高效的加載方案能夠最大化地保護細胞；

b.尋找對海藻糖具有選擇性吸收的加載方案，避免生成膜孔帶來不必要的物質交換導致紅細胞質量降低問題；

c.可以考慮將幾種海藻糖加載方法聯合使用，在保證高效載入的同時，達到對細胞膜的修復效果。

d.發(fā)展適用于臨床批量使用的低溫保護劑加載方案及紅細胞保存方案，推動未來紅細胞低溫保存實現標準化、規(guī)范化的臨床應用。