水產品中孔雀石綠快速檢測產品技術評價研究

◎ 張 凡，王一名，霍思宇，王海玲，余麗波，周 超，祁萌娜，余 洋

（1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176，2.中檢科（北京）測試認證有限公司，北京 100176）

孔雀石綠（Malachite Green，MG），又稱苯胺綠、孔雀綠、品綠、中國綠，分子式為C23H25ClN2，是一種人工合成的三苯甲烷架構的染料，因其外觀顏色呈孔雀綠而得名，由于其可以用來殺菌和防治寄生蟲而被作為防腐劑廣泛應用于水產養殖中?？兹甘G對人體免疫系統、生殖系統具有嚴重的致癌作用，而濫用孔雀石綠還可能誘發致病菌的耐藥性，對人體健康構成潛在危害[1-3]。我國農業農村部在2020年公布的第250號公告中，將孔雀石綠列為食品動物中禁止使用的藥品，美國和歐盟也早已禁止在食用性動物中使用孔雀石綠[4-5]。與其他抗真菌劑相比，由于其高效率、低成本和現成可用性，仍在世界許多地區的水產養殖中使用。

目前，關于孔雀石綠類化合物的檢測主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-串聯質譜法等檢測方法[6-7]。這些方法雖然準確度高、重復性好、適用于定量檢測，但存在成本高、操作煩瑣、設備昂貴、操作人員需專業培訓和檢測周期長等缺點，難以滿足基層現場快速篩查的需求。近年來，膠體金免疫層析技術發展迅速，具有前處理簡單、檢測成本低、對操作人員技術水平要求低等優點，適宜在基層推廣應用，被認為是目前最具應用價值和發展潛力的快速檢測技術[8-10]。在原國家食品藥品監督管理總局2017年第58號公告中，也發布了《水產品中孔雀石綠的快速檢測 膠體金免疫層析法》（KJ 201701），規定了快速檢測方法的相關技術要求。因此，為規范快速檢測的應用，合理發揮快檢技術的技術優勢，有必要對該類快檢產品進行質量評價[11-13]。

本研究選用含有孔雀石綠的魚肉、蝦肉質控樣品及含有結晶紫和隱色結晶紫干擾物的添加樣品，對4個廠家的孔雀石綠快速檢測試紙條進行測試，對檢出限、靈敏度、特異性、假陽性率和假陰性率等進行評價，以期為基層監管工作人員選購及應用孔雀石綠快速檢測試紙條提供參考，推進食品快檢技術在實際監管中的應用。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

含有孔雀石綠的魚肉、蝦肉質控樣品[中檢科（北京）實驗室能力評價有限公司]；魚肉、蝦肉陰性樣品為前期制備質控樣過程中飼喂宰殺并經國標方法檢測確認的樣品；干擾物樣品為陰性樣品加標并經國標方法檢測確認，均勻性穩定性符合《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》（CNAS—GL003：2018）要求（結晶紫200 μg·kg-1）；評價用快速檢測產品，從市場上購買4個廠家3個不同批次的快速檢測產品；結晶紫（純度99.0%以上，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 儀器與設備

電子天平，ME54.702，瑞士METTLER TOLEDO；均質器，FA30，上海弗魯克；水浴氮吹儀，ANPEL DC，上海安譜；渦旋儀，Talboys，上海安譜；移液槍，2 ～ 20 μL，德國 Eppendorf。

1.3 技術指標要求

依據《水產品中孔雀石綠的快速檢測 膠體金免疫層析法》（KJ 201701）及中檢科（北京）測試認證有限公司制定的《食品安全快速檢測產品評價指標體系》，快速檢測產品性能指標要求為檢出限≤2 μg·kg-1，靈敏度≥99%，特異性≥85%，假陰性率≤1%，假陽性率≤15%，交叉反應率≤0.1%，批內重復性≥96.4%，批間重復性卡方計算＜3.84。

使用陰性空白樣品、1倍檢出限陽性樣品質控樣、2倍檢出限陽性樣品質控樣、干擾物質檢出陽性的最小濃度添加樣品，按照快速檢測說明書規定的前處理方法和分析步驟進行，并對所有結果進行統計分析，評價快速檢測產品的相關指標是否符合《食品安全快速檢測產品評價指標體系》要求。

1.4 快檢產品的技術指標評價

1.4.1 檢出限評價

為評價快檢產品的檢出限，本實驗采用1倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質控樣進行檢測，分別使用3個批次快檢產品，每個批次檢測50份魚肉和50份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統計分析。

1.4.2 靈敏度和假陰性率評價

為評價快檢產品的靈敏度和假陰性率，本實驗采用1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質控樣進行檢測，分別使用3個批次快檢產品，每個批次檢測100份魚肉和100份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統計分析，計算靈敏度和假陰性率。

1.4.3 特異性和假陽性率評價

為評價快檢產品的特異性和假陽性率，本實驗采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品進行檢測，分別使用3個批次快檢產品，每個批次檢測40份魚肉和40份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統計分析，計算特異性和假陽性率。

1.4.4 交叉反應評價

為評價快檢產品的交叉反應，本實驗采用干擾物質檢出陽性的最小濃度的魚肉和蝦肉樣品進行檢測，分別使用3個批次快檢產品，每個批次檢測20份魚肉和20份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統計分析，計算交叉反應率。

1.4.5 批內重復性評價

為評價快檢產品的批內重復性，本實驗采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品、1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質控樣進行檢測，使用1個批次快檢產品檢測140份魚肉和140份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統計分析，計算批內重復性。

1.4.6 批間重復性評價

為評價快檢產品的批間重復性，本實驗采用魚肉和蝦肉陰性空白樣品、1倍檢出限濃度水平和2倍檢出限濃度水平的魚肉和蝦肉陽性樣品質控樣進行檢測，使用3個批次快檢產品，每個批次檢測140份魚肉和140份蝦肉樣品，嚴格按照快檢產品說明書進行檢測，并對檢測結果進行統計分析，計算批間重復性。

2 結果與分析

本次評價實驗選取市面流通中認知度較高的4種基于膠體金原理的孔雀石綠快速檢測產品，產品編號分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在評價實驗前，檢查所有快速檢測產品的包裝、說明書及配套試劑，均包裝密封完好，距離產品到期日4個月以上。此次評價用基質及檢測限與產品說明書契合。嚴格按照說明書規定的操作步驟及方法進行檢測，結果見表1、表2。

表2 評價指標計算結果表

評價結果顯示，4個廠家產品中，只有Ⅰ廠家產品所有指標符合要求；對于靈敏度和批內重復性，只有Ⅰ廠家產品檢測的兩種基質均符合要求，其余3個廠家產品檢測結果靈敏度均＜99%，批內重復性＜96.4%，不符合相應指標要求；對于特異性，4個廠家產品檢測的兩種基質均≥85%，滿足相應指標要求；對于交叉反應率實驗，只有Ⅰ廠家產品說明書提到，其余3個廠家均未提到，因此其余3個廠家未做交叉反應率實驗；對于批間重復性，除Ⅳ廠家產品不符合要求外，其余3個廠家均滿足批內重復性指標要求；另外對于不同的檢測基質，同一廠家產品的檢測效果也存在差異，如II廠家產品的魚肉靈敏度為98.7%，不滿足要求，而蝦肉靈敏度為99.3%，滿足靈敏度指標要求。

3 結論與討論

（1）此次評價的實驗設計中，4個廠家的快速檢測產品均具有國內相關機構出具的產品評價報告，相關性能指標顯示較好。但在此次驗證評價的過程中，部分品牌出現性能指標不理想的情況，反映出國內目前在售的快速檢測產品與送樣評價的快速檢測產品存在一定的差異性，單純采購前一次評價并不能代表全部生產線產品質量，應引入合格評定的概念，由專業的機構開展全鏈條產品質量考察及定期監督檢驗，供用戶參考選購。

（2）國內目前在開展相關評價實驗過程中，絕大部分機構參照《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》（CNAS—GL003：2018），制備均勻性和穩定性符合要求的基質加標樣品，也有部分機構使用沒有添加樣品基質的標準溶液。前者的制備成本較大，后者則忽略了基質效應對快速檢測產品的影響。因此，在開展評價實驗過程中，推薦使用的樣品為含有待測目標物的有證基質標準物質、標準物質生產者生產的含有待測目標物的基質質控樣品或含有待測目標物且均勻性和穩定性滿足統計學要求并經過參比方法定值的實際樣品或基質加標樣品。

（3）在此次評價的4種產品中，僅1種產品在說明書中提示了產品的交叉反應，可能存在部分廠家對交叉反應的重視不夠的情況。產品說明書中應明確提示交叉反應情況，以便用戶在開展快速檢測時對檢測樣品及檢測結果做出恰當的判斷。