茜素紅在食品硼酸檢測中的應用研究

◎ 楊 軍，熊 銳，黃 晶，陳 幟，梅 霞

(常德市食品檢驗所，湖南 常德 415000)

硼砂和硼酸具有增加食物韌性、脆度及改善食物保水性及保存度等功能[1]。硼砂經由食品攝取后，可與胃酸作用產生硼酸，硼酸不易被排出具有積存性，連續攝取后，會在體內蓄積，阻礙消化酵素作用，引起食欲減退、消化不良，抑制營養素的吸收，并產生嘔吐、腹瀉、紅斑、循環系統障礙、休克及昏迷等癥狀[2]。雖然世界各國都早已禁止使用硼酸和硼砂用于食品添加，但是仍有非法添加現象存在，在面制品中使用尤為頻繁。目前食品中硼砂或硼酸檢測方法為分光光度法[3]，相關研究中還有甲亞胺分光光度法[4]、原子吸收分光光度法[5]、電感耦合等離子體光譜法[6]和液相色譜法等檢測方法[7]。

姜黃素分光光度法是利用硫酸與姜黃混合生成的質子化姜黃與硼酸反應生成紅色產物，溶液顏色的深淺與樣品中硼酸含量成正比，通過比色可測定硼酸的含量；甲亞胺分光光度法主要利用甲亞胺的衍生物3-甲氧基-甲亞胺H作為硼顯色劑。兩種方法存在的主要問題有以下2點。①前處理費時且操作時間長，姜黃素法樣品前處理涉及沉淀蛋白質、使用有機萃取等費時費力操作[3]；甲亞胺分光光度法樣品前處理需要進行樣品消解或者高溫灰化[4]。②兩種分光光度法會使用到三氯甲烷、濃硫酸等毒性較大試劑或較危險試劑，檢測安全性上有隱患。此外，在環境檢測領域常用有熒光光度法和原子吸收分光光度法測定硼元素，但是在食品中檢測研究較少，且前處理涉及樣品消解或高溫灰化，也比較費時；原子吸收需要到特殊涂層的原子石墨爐，電感耦合等離子體光譜法和液相色譜法儀器成本高、檢測成本高、不易于大規模推廣。現有檢測硼酸的熒光光度法使用水反應體系，食品類樣品成分復雜，水提取溶液中會帶來大量熒光干擾物質，產生無法消除影響，限制了食品類樣品檢測應用。因此開發出一種準確率高、樣品前處理簡單、檢測時間短和檢測成本低的硼酸檢測方法對于食品安全監管具重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆干、掛面、面包、臘牛肉、醬板鴨和醬板魚。

硼砂，分析純，麥克林；硼酸標準貯備液（200 μg·mL-1），壇墨之間科技股份有限公司；正己烷，分析純，國藥集團；鹽酸，GR，國藥集團；氫氧化鈉（9.6 g·L-1）。

茜素紅溶液：分別用水、50%（V/V）甲醇水、50%（V/V）乙醇水將茜素紅配制成1.0×10-3mol·L-1，作為各反應體系顯色劑；pH緩沖溶液：分別用水、50%（V/V）甲醇水、50%（V/V）乙醇水將磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉分別溶解為6.0×10-2mol·L-1，臨用前按體積比1∶1，作為各反應體系的pH緩沖溶液；硼酸標準工作液：分別用水、50%（V/V）甲醇水，50%（V/V）乙醇水將硼酸標準貯備液配制成 0 mg·L-1、0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-18個梯度，作為各反應體系的標準工作液。

1.2 儀器與設備

F97PRO熒光光度計，上海棱光技術有限公司；ML204T/02萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9246D電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乙醇做提取劑的樣品前處理

稱取粉碎烘干后的食品10 g于50 mL塑料離心管中，加入25 mL無水乙醇、500 μL濃鹽酸，渦旋振蕩5 min后，于5 000 r·min-1離心機中離心3 min，取上清液5.0 mL于15 mL塑料離心管中，加入9.6 g·L-1的氫氧化鈉水溶液5 mL后搖勻，再加入2 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，于5 000 r·min-1離心機中離心3 min，去除上層正己烷層，下層清液為樣品待測溶液。

1.3.2 甲醇做提取劑的樣品前處理

稱取粉碎烘干后的食品樣品10 g于50 mL塑料離心管中，加入2.5 g氯化鈉、40 mL甲醇，渦旋振蕩5 min后，于5 000 r·min-1離心機中離心3 min，取上清液5.0 mL于15 mL塑料離心管中，加入5 mL純水后搖勻，再加入4 mL正己烷，渦旋振蕩30 s,于5 000 r·min-1離心機中離心3 min，去除上層正己烷層，下層清液為樣品待測溶液。

1.3.3 顯色及檢測

分別移取2 mL標準系列溶液和樣品待測溶液于10 mL塑料比色管中，依次加入pH緩沖溶液7 mL和茜素紅溶液1 mL，搖勻后置于溫度恒定處待溶液溫度穩定后用1 cm石英比色皿在激發波長460 nm，發射波長598 nm處用顯色后的0標校零，分別測量顯色后的標品和樣品溶液，用儀器自帶工具擬合標準曲線，樣品溶液熒光值在標準曲線上找出對應硼酸濃度，結合樣品前處理的稀釋倍數，可以計算出樣品中硼酸的含量。

2 結果與分析

2.1 波長的選定

根據已有研究的反應條件，硼酸、茜素紅與pH值為7.4的磷酸鹽緩沖水溶液混合后，使用儀器自帶三維波長掃描[8]。如圖1和圖2所示確實有比較明顯的特征峰，且茜素紅以及與硼酸和硼砂形成的形的絡合物形成的特征峰重和，最大激發波長都在460 nm左右，發射波長都在598 nm左右。

圖1 茜素紅熒光三維掃描等高圖

圖2 硼酸茜素紅熒光三維掃描等高圖

2.2 茜素紅濃度的確定

茜素紅自帶熒光特性且與形成的目標絡合物特征峰重疊，因此盡量降低茜素紅用量可以降低茜素紅本底值的影響，在10 mL的顯色反應中使用1.0×10-3mol·L-1茜素紅溶液1 mL即可保證硼酸濃度在0.1～100.0 mg·L-1范圍熒光值與濃度成正比，滿足大多數情況下的檢測需求。

2.3 緩沖溶液的選定

加入硼酸后，茜素紅溶液在pH值為6.0～9.0的各緩沖溶液中，均能檢測到比較明顯的熒光增強，但是隨緩沖溶液濃度增大，茜素紅本底熒光值升高明顯，也會導致在有機反應體系中導致鹽溶液析出，經過擇優選擇6.0×10-2mol·L-1磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉，臨用前按體積比1∶1混勻后使用顯色較為穩定。

2.4 不同反應體系對檢測的影響

實驗中發現在顯色反應中加入有機溶劑后，能夠提高硼酸或硼砂和茜素紅形成的絡合物的熒光強度，且體積比在50%左右時能達到最大增強效果，其中甲醇和乙醇都能形成較強增強作用，乙腈帶來提升很少。根據圖3不同反應體系三維波長掃描圖所示，將所有溶液的溶劑換為體積比為50%有機水溶液形成的不同反應體系，可以顯著提升絡合物的熒光值，提高檢測靈敏度。目前嘗試的有機溶劑中，甲醇對熒光顯色提升作用最大，比純水反應體系提高約3.7倍，擇優選擇50%甲醇水作為該實驗的反應溶劑。3種反應體系中，硼酸在0.1～100.0 mg·L-1濃度范圍內均能保證熒光強度與硼濃度成正比，如圖4所示擬合直線線性相關系數均在0.999以上。

圖3 硼酸茜素紅顯色反應中加入不同溶劑后的熒光三維掃描圖

圖4 硼酸在不同反應體系中的標準曲線圖

2.5 溫度和時間對檢測的影響

樣品提取溫度和顯色反應溫度對最終檢測結果影響并不大，硼酸或硼砂與茜素紅能夠快速的形成的穩定的絡合物，但是檢測溫度對熒光檢測影響比較大。圖5為10.0 mg·L-1硼酸顯色后在不同溫度下熒光強度，圖6為10.0 mg·L-1硼酸顯色后在不同時間段檢測的熒光值，考慮到檢測樣品過程中可能會帶來溶液溫度的變化，在恒溫條件將在顯色后溶液置于恒溫環境中反應10 min再檢測，同時熒光光度計也置于相同恒溫環境且提前預熱恒溫，如圖6所示在90 min內可以保證檢測熒光值穩定。

圖5 溫度對熒光檢測強度影響圖

圖6 顯色時間對熒光強度影響圖

2.6 不同提取劑加標回收率檢測

根據硼酸和硼砂的物理性質以及純標品提取驗證，水、甲醇、純乙醇均可作為硼酸的提取劑；水和甲醇可以作為硼砂提取劑，而硼砂通過在乙醇中加入濃鹽酸酸化后也可使用乙醇作為提取劑，但是使用含水溶劑進行樣品提取，會出現無法消除的熒光本底，無法實現檢測，因此樣品在提取前都需要烘干水分以降低雜質本底。如果使用純甲醇或純乙醇提取，則能避免水溶性熒光雜質干擾，大大降低了本底值，甲醇提取過程中通過加入氯化鈉可進一步降低雜質帶來的本底。提取后的純有機樣品提取液，會帶來脂溶性雜質，在50%甲醇水反應體系中會出現乳化現象，需要在顯色前通過加入等體積水析出脂溶性雜質再通過正己烷去脂解決。

根據表1驗證數據，通過對常用食品樣品的進行低濃度液標及高濃度固標加標驗證，使用甲醇或酸化后乙醇作為提取劑，樣品加標濃度在20.0～800.0 mg·kg-1內都能保證比較好的添加回收率，因此該方法適合大部分種類樣品的檢測。

表1 不同提取劑的樣品加標回收率表

3 結論

通過試驗探究，發現硼酸與茜素紅的熒光顯色特性由于其高靈敏性及穩定性，可以用于食品中硼酸的檢測。根據已有驗證數據，將樣品粉碎烘干后，通過甲醇+氯化鈉或者這乙醇+鹽酸的方式提取，再結合正己烷除脂得到的樣品待測液，在50%甲醇-水反應體系中，可以快速準確的完成食品中硼酸后硼砂，樣品前處理簡單易行，所用試劑易得且相對安全，檢測所需的熒光檢測儀成本遠低于液相色譜、原子吸收等大型儀器，適合大部分固體食品類樣品的快速檢測，利于推廣運用。但是該方法暫時無法檢測基質復雜的液體類食品，針對液體樣品的前處理方法還需要進一步研究。