牛奶中丙酸桿菌的篩選與鑒定

◎ 孫 彪

（甘肅省武威市政府網站，甘肅 武威 733000）

現階段，較多學者正在研究應用丙酸桿菌完成丙酸的制備。但不同培養基的菌群分離效果不一致，在篩選和鑒定菌株的方式上存在差異性?；诖耍疚难芯颗Ｄ讨斜釛U菌的篩選和鑒定方法，并探討從牛奶中分離出來的菌種類型，為其早日投入工業化生產提出理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

新鮮生牛乳，甘肅省武威市涼州區興旺奶肉牛廠；ATCC25923金黃色葡萄球菌，美國標準生物品收藏中心；DNS試劑，上海酶聯生物科技有限公司；高錳酸鈉，廣東航鑫科技股份公司；硫氫化鈉試劑，菏澤宏昌生物科技有限責任公司。

光學顯微鏡，型號為Axio Vert.A1，北京普瑞賽司儀器有限公司；色譜儀，型號為GC7890，山東神礦重工有限公司；生化培養箱，型號為SRT-1270，上海程斯智能科技有限公司；冷凍離心機，型號為DL6M，湖南凱達科學儀器有限公司；分光計，型號為UV-9100，北京瑞利分析儀器公司；西亞試劑盒，成都西亞化工股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備菌種培養基

以新鮮牛奶為樣品梯度稀釋原材料，將牛奶均勻涂在實驗試劑存放平板上，按照丙酸桿菌的分離培養基形式進行培養[1]。此次實驗的培養基類型分為篩選培養基與分離培養基2種，在3種培養基制備過程中選擇其中一組進行對比，以分離培養基作為丙酸桿菌的對照組，按照同等形式進行各類型菌種制備。

在篩選培養基中加入2%的葡萄糖和0.000 2%的粘菌素。分離培養基中加入2%的甘油成分，加入10%葡萄糖，2種培養的pH值均控制在6.7～7.2。

通過對菌種培養基的進行分類制備，在菌種發酵后進行離心處理，整個離心過程控制在4 000 r·min-1，即可獲取觀察清液。在38 ℃的實驗室環境內進行培養，24 h內通過儀器觀察到的菌種變化情況，選擇肉眼可見且成長速度較快的單個菌落進行分離純化，并根據菌落的分布特點進行初步歸檔分類，完成丙酸桿菌的待選菌株篩選。

1.2.2 分離純化培養丙酸桿菌

在每個需要分離的菌體溶液中，按照1～10 mL的大小進行試管準備。分離全過程包括樣本的初選和復選，多次篩選能分離出較為純化的丙酸桿菌[2]。初選時將鮮牛奶分成若干等分，通過上述3種培養基進行培養制備，在恒定的35 ℃保養箱中靜置4 d。

初次先在篩選培養基中吸取2 mL溶液，同時與2 mol·L-1硫酸進行混合，在試管中進行煮沸判斷氣體中是否有酸性物質產出。若沒有，則將等量分配的鮮牛奶重復上述步驟，直到存在酸性物質產生。若產生了揮發酸物質，可將篩選培養基中的物質分出15%，嫁接到富集培養基中進行為期3 d的培養。通過反復嫁接接種，在進行4輪后可完成生理純化增殖，使得丙酸桿菌具有優勢菌的特點。

在完成反復培養后對分離培養基進行平均分離，將其置于在35 ℃培養箱中進行后續培養，維持在7 d以上，直接進行單個菌落的挑取即可。將通過分離得到的丙酸桿菌接種在帶有篩選培養基的容器內，在溫度在30～35 ℃進行為期5 d的培養，直至篩選出具有較大程度的乳白色發酵液體，再利用高效液相色譜進行丙酸桿菌的定量轉化。

1.2.3 高效液相色譜分析

將菌種按照體積分類，以3%的體積分數進行接種量配比定量轉化，對每個染色后的菌株編號，進行培養物的提取和菌體收集。被打濕的菌體需要和谷氨酸鈉溶液進行充分混合，分別在35 ℃、65 ℃及85 ℃下進行振蕩，每次融合的溶液按照1∶40（m/v）進行，在細胞液完成洗脫制備后，進行高效液相色譜的定量轉化定性分析[3]。

對篩選分離的丙酸桿菌進行定量分析，按照高效液相色譜法進行洗脫程序設定。按照AGILENT的色譜柱采集標準，在紫外線監測儀器測試波長為355 nm的長度下，進行25 mm×5.2 mm，10 μm的色譜柱洗脫。其流動相選用5 mmol·L-1的稀硫酸溶液，其流動相流速設定為0.5 mL·min-1，柱溫設定為30 ℃，進樣間隔設定為20.5 min，質量濃度與峰面積的回歸方程為y=559 847x+29 157，式中x代表質量濃度，單位為g·L-1；y代表峰面積，其決定系數r2=0.999 8。將3組定量轉化完成的培養基進行丙酸桿菌的形態鑒定及生化鑒定。

1.2.4 丙酸桿菌形態、生化鑒定

（1）丙酸桿菌形態鑒定。定量轉換完成后，將兩個培養基中培養的丙酸桿菌菌株放置于超凈工作臺中，分別挑選單獨菌落進行革蘭氏染色至G+，放置于光學顯微鏡下進行形態鑒定。丙酸桿菌外觀為桿狀，大小為0.4～0.7 μm，菌落呈白色、無芽孢、不運動，依據此標準完成丙酸桿菌形態鑒定。

（2）丙酸桿菌生化鑒定。在丙酸桿菌生成量的對比中，40 min獲取一次生成量數據，并進行生化鑒定。

采用DNS法測定葡萄糖的殘留量。取不同濃度的葡萄糖溶液各1 mL，分別加入DNS試劑，水浴加熱5 min，取出冷卻后，用水定容至10 mL，顯色后測試其吸光度，繪制標準曲線，之后再選取葡萄糖培養基培養的丙酸桿菌在蒸餾水中定容，進行葡萄糖殘留量的測定[4]。

每40 min利用比色法測定甘油的殘留量。取不同濃度的甘油溶液各1 mL，利用高錳酸鈉溶液和硫氫化鈉試劑測定其吸收波長，顯色后在412 nm下利用分光計測定其吸光度，繪制標準曲線，之后再選取甘油培養基培養的丙酸桿菌在蒸餾水中定容，進行甘油殘留量的測定[5]。

2 結果與分析

2.1 菌株形態鑒定

通過實驗制備丙酸桿菌菌株，對其進行形態鑒定。不同培養基指標下菌群樣本形態特征如圖1所示。由圖1（a）和圖1（b）可知，不同變化指標下生成的丙酸桿菌形態不一致，呈現出來的分布效果也不同。

圖1 不同培養基指標下菌群樣本形態特征圖

2.2 不同培養基的丙酸桿菌生成量對比

為驗證兩個變量對丙酸桿菌的影響，以同等制備丙酸桿菌的時間內，進行兩個指標下丙酸的生成量對比測試，具體測試結果如圖2所示。

根據圖2內容所示，在葡萄糖培養基中丙酸的生成量變化較大，甘油培養基中丙酸的生成量較為穩定。對比兩個指標下的丙酸生產高值來看，葡萄糖培養基中的生成量最大值能達到7.0 g·L-1，甘油中的丙酸生成量最高為 6.2 g·L-1。

2.3 丙酸桿菌生化鑒定對比

在完成丙酸的生成含量測試后，對其桿菌內部的殘留量加以測試，驗證不同變化指標的發酵能力。以同等時間變化下兩者殘留量為對比條件，在3個樣本中對照培養時間點，進行多輪殘留量的結果對比，具體結果如表1所示。

根據表1中內容所示，在3組樣本中葡萄糖和甘油2種指標均能被消耗，但不同培養基含量中的消耗速度不同。葡萄糖的消耗量較快，在第160 h之前消耗完成；而甘油的消耗量較慢，只有在初期才會發生較大數值變化，后期消耗速度比較平穩。由此能夠得出結論：葡萄糖和甘油的殘留量主要與丙酸的生成量相關，生成的速度越快，其殘余量越少。

表1 丙酸桿菌中葡萄糖及甘油指標殘留量對比結果表（單位：g·L-1）

3 結論

本文在制備不同類型的培養基基礎上，以葡萄糖和甘油作為丙酸桿菌的變化量，設計牛奶中丙酸的篩選和鑒定方法。根據實驗結果可知，分別將葡萄糖和甘油放入培養基內，在不同培養時間內測試丙酸的生成量，選用葡萄糖培養基，在180 h內能夠生成7 g·L-1的丙酸含量，具有實際應用效果。但由于在測試過程中只針對制備的篩選項培養基進行測試，所得結果具有一定偏差性，后續研究中會進行更多側重點分析，為丙酸桿菌的篩選和鑒定提供科學方法。