超高效液相色譜-串聯質譜法測定腌魚中氟蟲腈及其代謝物的殘留

◎ 楊 坤，劉桂瓊，管春成，龍姜柳，顧 陽

（黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012）

腌魚是貴州省黔東南州侗族地區特色傳統發酵型魚產品，是稻田鯉魚通過去除內臟、食鹽腌制后，加入辣椒粉、醪糟、白酒等輔料混合均勻于壇子密封自然發酵3個月以上，制成一種風味獨特、味道鮮美的民族特色食品[1-2]。因其有助消化和特有的酸辣甜風味等特點，具有很好的市場前景。

氟蟲腈又名銳勁特，由法國羅納-普朗克公司研發，其通過作用于昆蟲γ-氨基丁酸受體，干擾昆蟲的中樞神經引起昆蟲神經和肌肉過度興奮直至死亡，從而達到殺蟲作用[3-4]。氟蟲腈主要用于防治水稻、玉米及其他經濟作物的蟲害，被眾多農藥專家推薦為替代高毒有機磷農藥的選擇之一，成為防治蟲害的新主力[5-7]。氟蟲腈是一種化學結構不穩定的農藥，使用后經光照、水解等作用會產生氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈等毒性極高的代謝產物[8]。氟蟲腈雖已被國內外禁用，但近年來仍存在農藥隱性添加而導致氟蟲腈陽性檢出的現象，歐洲16國等地更是爆出了大規模的氟蟲腈污染雞蛋的食品安全事件，造成惡劣的食品安全事故[9]。

目前，食品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法[10]、液相色譜法[11]和液相色譜-串聯質譜法[12]，其前處理方法有QuEChERS法[13-14]和PRiME HLB法[15]，但這些文獻主要以茶葉、水果蔬菜、豬肉為研究對象，沒有專門針對有關魚類產品中氟蟲腈及其代謝物的分析。本文旨在研究不同的樣品前處理方法對發酵腌魚中氟蟲腈及其代謝物的凈化效果和基質效應的影響，建立一種高效簡便的分析腌魚中氟蟲腈及代謝物的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLCMS/MS），以期為魚類產品中氟蟲腈及其代謝物的快速分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6批次腌魚購置于凱里市，5批次購置于黎平縣，4批次購置于錦屏縣，4批次購置于從江縣，3批次購置于榕江縣。

氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈等4種農藥標準溶液質量濃度均為100 mg·L-1，壇墨質檢科技股份有限公司；甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；乙酸銨，優級純，國藥化學試劑有限公司；氯化鈉，優級純，天津科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鎂，優級純，國藥化學試劑有限公司；C18，40～63 μm，安捷倫科技；N-丙基乙二胺（PSA）40～63 μm，安捷倫科技；試驗用水為超純水；PPRiME HLB固相萃取柱（6 mL，300 mg）。

1.2 儀器與設備

4000+型質譜聯用系統，美國AB SCIEX公司；Agilent 1290型液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q型純水機，美國Millipore公司；ML104型電子天平，梅特勒-托利多（上海）儀器公司；Multi Reax型多位試管振蕩器，德國Heidolph公司；3-18k型高速冷凍離心機，德國Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

（1）標準使用液的配制。吸取100 mg·L-1氟蟲腈及其代謝物標準溶液1.00 mL于同一容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，配制成10.00 mg·L-1混合標準儲備液，該溶液可在4 ℃下避光保存3個月。使用前，吸取0.10 mL于100 mL容量瓶中，用初始流動相稀釋至刻度，配制質量濃度為10.0 ng·L-1的混合標準使用液，現配現用。

（2）基質匹配標準溶液的配制。移取5份空白樣品凈化溶液1.00 mL于5 mL離心管中。再分別加入混合標準使用液 25.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、200.0 μL和500.0 μL，氮吹至近干，加入流動相初始液1.00 mL溶解，配制成質量濃度為 0.25 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1和 5.00 ng·mL-1的基質匹配標準溶液系列，現配現用，過濾膜后待測。

1.3.2 樣品處理方法

稱取2.0 g（精確至0.01 g）腌魚樣品至50 mL離心管中加5 mL水渦旋混合5 min，再加入乙腈10.0 mL、4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，渦旋提取10 min，10 000 r·min-1冷凍離心5 min，吸取2.0 mL乙腈提取液于含有150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA和50 mg C18的凈化管中渦旋凈化1 min，靜置后取1.00 mL上清液于5 mL離心管中氮吹至近干，加入流動相初始液1.00 mL溶解，過濾膜后待測。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進樣體積2 μL；流速0.30 mL·min-1；流動相A為含0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液，B為含0.1%甲酸的甲醇溶液。洗脫程序：0～2.5 min，40%A；2.5～3.5 min，20%A；3.5～5.0 min，20%A；5.0～ 5.1 min，40%A，5.1～7.0 min，40%A。

（2）質譜條件。電噴霧負離子源（ESI-）模式；離子噴射電壓-4 500 V；去溶劑溫度550 ℃；氣簾氣壓力138 kPa；碰撞氣壓力41 kPa；輔助氣1壓力414 kPa；輔助氣2壓力379 kPa；掃描方式：多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式，其他質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

氟蟲腈與其代謝物的化學結構極為接近，酸度系數為-4.0～-6.0，且極性均偏弱[12]。查閱其他文獻均選擇BEH C18色譜柱作為分離柱[8-14]，本文分別對乙腈-水、乙腈-5 mmoL·L-1乙酸銨溶液、甲醇-水、甲醇-5 mmoL·L-1乙酸銨溶液、0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液為流動相進行研究，當以0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液作為流動相時，4種化合物具有較好的分離效果和靈敏度。因此，選擇0.1%甲酸的甲醇和0.1%甲酸的5 mmoL·L-1乙酸銨溶液作為流動相。

2.2 質譜條件的優化

分別配制0.2 μg·mL-1的各化合物標準溶液，使用蠕動泵持續注入質譜儀對氟蟲腈及其代謝物的質譜參數進行確認。氟蟲腈及其代謝物中含有多種鹵代基團，在負離子源上具有更高的強度[12]。因此，可對4種化合物進行負離子電噴霧母離子（Q1）掃描，確定其母離子，再進行二級質譜掃描（MS2），每個化合物選擇2對響應值高的特征離子對作為定量及定性離子對，并對質譜參數進行優化，優化后結果見表1。

表1 質譜參數表

2.3 前處理技術的優化

2.3.1 提取條件的選擇

氟蟲腈及其代謝物極性偏弱，在提取過程中易溶于乙腈溶液中，QuEChERS法自誕生以來主要研究應用于植物源性食品，成為農藥殘留檢測的首選。因此，本試驗主要以腌魚為基質研究QuEChERS前處理凈化優化。試驗使用乙腈作為提取溶劑，比對不同鹽析劑進行提取的效率。以含量為2.5 μg·kg-1的加標樣品，分別按以下方法進行提取。方法1，加0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL提取。方法2，加乙腈溶液10 mL提取。方法3，加水5 mL分散，再加乙腈溶液10 mL提取，5 g氯化鈉鹽析。方法4，加水5 mL分散，再加乙腈溶液10 mL提取，4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉鹽析。其提取液直接上機測試，氟蟲腈及其代謝物的回收率對比如圖1所示。

由圖1可知，方法4中4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉作為鹽析劑的提取效果最佳，這是因為緩沖液更促進鹽析脫水，使化合物分配更易從水相轉移至有機相，從而提高溶劑的提取效率。

圖1 不同提取方法氟蟲腈及其代謝物的提取效率對比圖

2.3.2 凈化條件的選擇

腌魚是一類發酵后的水產品，除含有大量脂肪和蛋白質外，還含有少量辣椒素、色素等雜質。QuEChERS凈化包主要有GCB、C18和PSA 3種吸附劑，文獻[3]已驗證GCB易吸附4種農藥，50 mg C18+50 mg PSA組合在禽蛋和蛋制品上具有較好的凈化效果。因此，本試驗在其基礎上考察了PRiME HLB、QuEChERS和PRiME HLB結合QuEChERS等方式在腌魚基質中的凈化效果，各取2 mL提取液于PRiME HLB柱、QuEChERS凈化包和PRiME HLB結合QuEChERS凈化包中凈化，接收1.00 mL凈化液后氮吹近干并用流動相初始液復溶至1.00 mL，過0.22 μm濾膜上機。從圖2可知，PRiME HLB凈化4種目標化合物的回收率為74.76%～92.94%，PRiME HLB結合QuEChERS凈化4種目標化合物的回收率81.45%～113.69%，QuEChERS凈化除了氟蟲腈亞砜回收率為83.27%外，其他3種目標化合物回收率在86.05%～98.65%，回收效果滿意。因此，本研究采用QuEChERS凈化法對腌魚樣品進行前處理。

圖2 不同凈化條件氟蟲腈及其代謝物的回收率比對圖

2.4 標準曲線、檢出限與定量限

在儀器工作條件下對基質匹配標準溶液系列進行測定，以質量濃度為橫坐標，以其相對應的峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線，在0.25～10.00 ng·mL-1呈良好的線性關系，相關系數均＞0.999；在1.0 ～ 10.0 μg·kg-1，氟蟲腈及其代謝物的回收率為91.79%～109.84%，相對標準偏差為0.91%～3.39%（n=6）；以3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比計算檢出限和定量限，方法檢出限和定量限分別為0.2～0.4 μg·kg-1和 0.8 ～ 1.2 μg·kg-1，結果見表3。

表3 線性參數、檢出限和定量限表

2.5 精密度和回收試驗

在 腌 魚 基 質 空 白 樣 品 中 分 別 按 1.0 μg·kg-1、3.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-13 水平進行加標試驗，每個添加水平重復測定6次來測定回收率，結果見表4。結果表明，3個添加水平下腌魚樣品中氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為91.79%～109.84%，相對標準偏差為0.91%～3.39%。說明該方法符合腌魚中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測的檢驗方法要求。

表4 精密度和回收試驗結果表（n=6）

2.6 樣品分析

按照試驗方法對22批次腌魚進行檢測，除了1批次腌魚樣品檢出氟蟲腈砜陽性離子且低于檢出限外，其他腌魚均未檢出。

3 結論

本文系統地研究了3種不同的樣品前處理方法對發酵腌魚中氟蟲腈及其代謝物的凈化效果和基質效應影響，建立了UPLC-MS/MS同時測定腌魚中氟蟲腈及其代謝物殘留的分析方法。結果表明該方法簡便、靈敏，各檢測指標均滿足分析檢測的要求，且適用于腌魚中氟蟲腈及其代謝物殘留的快速定性、定量分析。