以凝固型發酵乳為樣本探究pH對大腸菌群的影響

◎ 李玉平，李 鵬，孫叢叢，凌 森

（河北三元食品有限公司，河北 石家莊 050700）

溶液的pH值等于溶液中氫離子濃度的負對數，代表了溶液的酸堿度。pH值是影響微生物生長的一個關鍵因素，微生物會因細胞內蛋白質的變性和核酸的變異出現生物活性下降的現象；當pH有所改變時，營養物質會因受到影響而發生改變，導致營養物質的有效利用率降低，微生物的生長速度隨之下降[1]。不同微生物適宜生存的pH環境不同，在溫度、水分等條件適宜的情況下，菌體內酶的活性在最適pH或最適pH區間時最高，生長速度也最快，環境的pH發生變化會在一定程度上影響微生物的生長速度，在一定pH區間外微生物會受到損傷而死亡[1]。

大腸菌群（Coliforms）一般指一群在特定培養條件下能夠發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[2]。該菌群與人們的生活息息相關，常出現在糞便和被糞便污染的地帶。大腸菌群計數是評價食品衛生狀況的重要指標之一，在食品衛生方面中得到廣泛使用[3]。大腸菌群含量的高低不僅可以反映食品被糞便污染的程度，還可以直接影響食品的儲存期、口感和人體健康。大腸菌群是條件性致病菌，其較強的產毒能力決定了其具有較低的感染劑量，感染大腸菌群后的中毒反應有發熱、嘔吐、腹瀉和腹痛等。一直以來人們都在不斷關注著影響大腸菌群檢測結果準確性的因素及注意事項，持續探究著大腸菌群的生存特點。為了得到更加準確的大腸菌群計數結果，首先要熟練掌握國家檢驗標準，從方法的適用性、培養基及試劑的滅菌要求、使用溫度和使用量、操作步驟（樣品稀釋、接種時間、培養溫度和時間）、平板計數和證實試驗到結果報告等每個環節都要嚴格按照標準要求進行。在研究大腸桿菌的生存特點時發現，在不同的極端環境下，大腸桿菌會產生不同的應激機制，有針對性地對抗高壓、低溫、高熱和高酸等壓力帶來的威脅。近幾年有不少學者對大腸桿菌的耐酸性進行了研究，不同的酸性條件下大腸桿菌的生長情況也不盡相同。

李小媚等[4]研究表明，pH值為5.0～7.0時，大腸桿菌（0157:H7）可以良好地生長；pH值為2.0～4.0時，大腸桿菌（0157:H7）的生長受到了抑制；當pH值＜2.0時，大腸桿菌（0157:H7）幾乎被全部殺死。另外，當環境中的pH值不同時，大腸桿菌（0157:H7）所呈現出來的形態也有所不同，當環境的pH值降低時細胞由長桿狀變成短桿狀或橢圓狀，由此可見大腸桿菌（0157:H7）對酸的耐受性較強，可以很好地對抗酸性環境對其生長的影響。這一特性使得酸性果汁、乳制品等酸性或發酵食品極易被大腸桿菌污染，同時也反映出了在對食品進行大腸菌群計數檢驗過程中，pH是影響檢測結果的重要因素之一[5]。為探究不同pH值對大腸菌群生長的影響，本試驗以凝固型發酵乳為樣本，采用平板計數的方法，分別對存放前后的已接種等量大腸埃希氏菌的不同pH值的樣本稀釋液進行大腸菌群計數。通過比較存放前后大腸菌群含量的變化來判定pH對大腸菌群生長的影響[6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

滅菌吸管、直徑為90 mm的無菌平皿、無菌錐形瓶、試管和水浴鍋，上海新苗醫療器械制造有限公司；（36±1）℃電熱恒溫培養箱，DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司；pH計，DELTA320，梅特勒托利多有限公司；電子天平，T1000，常熟市雙杰測試儀器廠；高壓滅菌器，YXQ-100A，上海博訊實業有限公司。

1.2 試劑

0.85%無菌生理鹽水、1 mol·L-1NaOH 溶液、1 mol·L-1HCl溶液，均為自制。

1.3 培養基

本次試驗使用的培養基均按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》（GB 4789.28—2013）的要求進行質量驗收，且驗收合格的商品化脫水合成培養基。

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）：嚴格按照培養基標簽上的方法進行配制，臨用前制備。

煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：嚴格按照培養基標簽上的方法進行配制，分裝至放有倒置玻璃小導管的試管中，每管10 mL，121℃條件下高壓滅菌15 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液

本次試驗使用的是從美國典型菌株保藏中心購入的大腸埃希氏菌，菌懸液由儲備菌株在BHI（非選擇性肉湯）中培養過夜后制得[7]。

1.4.2 樣品稀釋

無菌條件下，準確稱量50 g樣本于裝有50 mL無菌生理鹽水的容器中，充分混勻，共制備6份，對稀釋液分別編號為S0、S1、S2、S3、S4和S5，用1 mol·L-1NaOH 溶液和 1 mol·L-1HCl溶液調節各稀釋液的pH值，測得各稀釋液的pH值依次為4.4（未調pH）、2.0、3.0、4.4（未調pH）、5.3和6.8。

1.4.3 大腸菌群計數

（1）對S0（未接種）進行大腸菌群計數測試。用無菌吸管吸取S0稀釋液于2個無菌培養皿中，每皿2 mL，此接種量相當于1 mL樣本原液，記為100；同樣量取2 mL S0稀釋液至裝有8 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻，用無菌吸管量取上述勻液至2個無菌平皿，每皿1 mL，此接種量相當于0.1 mL樣本原液，記為10-1。另取1 mL無菌生理鹽水至無菌培養皿中，作為空白對照。

（2）對S1～S5（接種）進行大腸菌群計數測試。向稀釋液S1、S2、S3、S4和S5中分別加入ATCC 25922大腸埃希氏菌的工作菌懸液1 mL，振蕩均勻，用無菌吸管吸取各個已接種的稀釋液，分別接種至2個無菌平皿，每皿2 mL，記為100；量取2 mL各稀釋液于盛有8 mL無菌生理鹽水的試管中，充分混勻，記為10-1；用無菌吸管量取10-1勻液1 mL于盛有9 mL生理鹽水的試管中（吸管尖端不要觸及稀釋液面），充分混勻，制成10-2的樣品勻液。按前面的操作，制成10倍遞增系列稀釋液。每個稀釋度，換用1支無菌吸管。取多個連續稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。

（3）向所有平皿中倒入46 ℃左右的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂，每皿需倒15～20 mL。順時針搖晃平皿，使培養基和接種的樣液混合充分，放置一段時間，至瓊脂完全凝固后，倒入3～4 mL VRBA覆蓋整個平板。完全凝固后，將平皿倒置，在（36±1）℃條件下培養18～24 h。

（4）接種完成后，將稀釋液S1～S5放置6.5 ℃環境中存放1 d，重復上述操作。

（5）培養結束后，嚴格按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）9.3的規定，計數典型和可疑菌落數。典型菌落是紫紅色，有紅色的膽鹽沉淀環在其周圍。嚴格按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）9.4證實試驗的規定，從VRBA平板上取10個典型單個菌落，轉種于BGLB肉湯試管內，于（36±1）℃條件下培養24～48 h，結果BGLB肉湯管均有氣體產生。

2 結果與分析

試樣S0（未接種）的計數結果為＜1 CFU·g-1，說明樣本沒有被大腸菌群污染；分別對S1～S55個試樣的各稀釋度平板進行大腸菌群計數，結果見圖1。

從圖1可以看出，試樣的pH值為4.4～6.8時，存放前后大腸菌群數量沒有明顯變化，數量級不變，由此可見，大腸菌群有較強的耐酸性；試樣的pH值=3時，存放前后大腸菌群含量由7.8×106CFU·g-1減少至1.3×104CFU·g-1，pH值的降低明顯影響了大腸菌群的生物活性；試樣的pH值＜3時，存放后大腸菌群幾乎全部死亡，含量由7.5×106CFU·g-1減少至0，大腸菌群在酸性較高的環境下受到嚴重損傷而死亡。綜上，本次試驗結果表明，當大腸菌群含量較大時，不同的pH值對大腸菌群有不同程度的影響，pH值在4.4～6.8時對大腸菌群沒有明顯抑制性；pH值≤3時對大腸菌群有顯著抑制性。

圖1 試樣S1～S5存放前后大腸菌群含量變化趨勢圖

3 結論

大腸菌群對酸有較強的耐受性，在pH值≤3的條件下受到顯著抑制。大腸菌群計數是評價食品衛生污染狀況的重要指標，為了準確得到食品中大腸菌群的含量，檢測過程應注意培養基以及樣品勻液的pH值，調節pH值至國家標準要求的范圍。另外，產品在存放過程中pH值的變化也會對大腸菌群的含量有影響，因此要注意檢測的及時性。