酶聯免疫吸附技術在食品微生物檢測中的應用

邱 黎

（南平市產品質量檢驗所，福建南平 353000）

食品安全事關國民生計和人們的身體健康，其中食品微生物污染是導致食品安全問題的主要因素之一。細菌和真菌數量過多極容易造成食品的腐敗變質，進而導致人們在食用后發生腹瀉、嘔吐、發熱等癥狀，嚴重影響到人們特別是青少年的身體健康。為保障廣大消費者的飲食安全，必須科學合理地使用微生物檢測技術，杜絕微生物指標超量的食品流入市場。因此，研究食品安全檢測過程中的微生物含量顯得尤為重要。本文綜述酶聯免疫吸附技術在食品微生物檢測領域的應用與優勢，使用酶聯免疫吸附技術快速識別和區分不同的微生物，為食品安全提供強有力的保障。

1 酶聯免疫吸附技術概述

1.1 酶聯免疫吸附技術研究現狀

酶聯免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）又稱為酶聯免疫法，是基于免疫酶技術發展形成的一種新型免疫測定技術[1]。該技術是繼免疫熒光、放射免疫技術之后，又重新建立的使用酶來標記抗原或抗體的檢測技術。傳統病原微生物檢測方法主要采取分離培養或者生化試驗的方法，不僅需要人工操作，而且檢測周期較長。酶聯免疫吸附法極大地提高了檢測效率，這是由于酶具有較強的生物催化效果，一個酶分子在幾分鐘內就可以催化出幾十甚至上百個底物分子，使得檢測效果放大，原來微乎其微的抗原或抗體在短時間內就可以迅速標識[2]。

酶聯免疫吸附法于1971 年被ENGVALL[3]首次提出，并發表了酶聯免疫吸附劑用于IgG 定量測定的文章，使得該技術發展成為液體標本中微量物質的常用測定方法，而后國內外眾多專家學者相繼研究這一領域，逐漸成為熱門前沿課題。1972 年，ENGVAIL 等[4]改用酶標記免疫球蛋白，使標記效率大幅度提高，進一步破解了半抗原標記不夠準確的問題，同時簡化了檢測過程。1975 年，KOHLER 等[5]開發生產的抗原特異性單克隆抗體技術，作為檢測復雜蛋白質混合物的重要試劑，使抗體的制備水平達到一個新的高度。20 世紀90 年代以來，隨著免疫標志物技術的快速發展，ELISA 技術得到了社會的廣泛認可，其靈敏度和特異性都有了顯著的提高，可實現對細菌、生物毒素、轉基因食品等方面的準確 檢測。

1.2 酶聯免疫吸附技術原理

ELISA 檢測技術主要采用酶分子和抗體或抗原相結合的方式，該技術既可以保持抗體本身的免疫學活性，也不影響酶的生物學活性。這種酶標記的抗體能夠以物理形態吸附于固相載體表面，與載體表面抗原或抗體進行特異性反應，通過與酶相融合產生酶的結合物，整個過程具有較強的免疫學活性。形成的酶結合物和抗原或抗體發生反應，在加入底物溶液后，根據顯色的變化來判斷是否發生了免疫反應，顯色變化的深淺與樣本中抗體或抗原呈正比關系。顯色的深淺程度需要通過ELISA 檢測儀進行精準判斷，通過顯示試驗結果來確定樣品中待測物質含量，這樣可以將酶的敏感性與抗原抗體的特異性更好地結合起來，使ELISA 檢測技術既符合特異性，又具有敏感性，以此達成檢測目的。

2 酶聯免疫吸附技術的分類方法

根據反應途徑的不同，ELISA 技術最常見的測定方法主要有直接測定法、間接測定法和雙抗夾心法等，每種測定技術都有其優勢和不足，需要根據具體檢測的樣本、用途等選擇合適的方法。在ELISA測定方法中需要準備3 種必要的試劑來保證測試的精準，即固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物。ELISA 技術方法反應示意見圖1。

圖1 ELISA 技術方法反應示意

2.1 間接測定法

ELISA 間接法在所有方法中最為常用，該方法是對被試抗體通過酶標記與固相結合，對被試抗體進行檢測，故稱為間接法。具體操作過程是將特異性抗原吸附于固相載體上，從而生成新的固相抗原，再加入需要檢測的樣本，抗體與固相抗原結合能夠生成復合物，再加入酶標記的抗抗體與復合物相結合，通過沖洗，在固相中的生物活性即為特異性抗體的數目。最后加入底物顯色，由于每個過程都需要沖洗，如果檢測樣品中不含有對應的這種抗體，酶標抗體在這個階段就會被沖洗干凈，底物不顯色代表檢測結果呈陰性，如果檢測樣品中含有對應的這種抗體，底物顯色則代表檢測結果呈陽性，染色深度代表樣品中檢測到的抗體數量。該方法的主要優勢在于抗抗體可以加強信號，不加酶標記的一級抗體則能夠保留免疫反應性。其主要缺點是相比較于其他方法，交互反應出現的概率上升。

2.2 直接測定法

直接法與間接法有所不同，是將特異性抗原吸附于固相載體上，從而生成固相抗原，加入酶標記的一級抗體，樣品中的抗原和酶標抗原競爭與固相抗體相結合，結合的程度越好，酶標抗原與固相抗體結合的機會就越小，加入底物后就不會顯色或者顯色很淺，即可測定抗原總量。該方法的主要優勢在于操作過程簡單，因不需要使用抗抗體，能夠避免交互反應。其缺點是試驗中的抗體都需要用酶來標記，但并不是任何一種抗體都適合做標記，且費用相對較高。

2.3 雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是將特異性抗體包附于固相載體上，經沖洗一次后，加入含有酶標記抗原的待檢測樣本，如兩者具有特異性則發生反應，再加入與待測抗原呈特異反應的酶聯抗體，使一單位的抗原同時結合兩單位的抗體由此形成“夾心”，再加入底物顯色進行測試，根據有色酶解產物顏色有無和深淺變化，確定待測試抗原的含量。該方法的優點在于靈敏度高、專一性強，抗原不需要提前進行純化，但缺點是雙抗體夾心法常用于檢測二價或二價以上的大分子抗原，對于半抗原及小分子單價抗原檢測的準確性不足，這是因為該方法的抗原需要擁有至少兩個或兩個以上的抗體結合部位，但半抗原及小分子單價抗原不能形成兩位點夾心，故檢測效果不明顯。

3 酶聯免疫吸附技術在食品微生物檢測中的應用

酶聯免疫吸附試驗在食品毒害物質的檢測中有著良好的應用效果，食品微生物檢驗內容主要包括菌落總數、大腸桿菌、霉菌、沙門氏菌等致病菌檢驗，可實現對食品細菌、真菌毒素的檢測。

3.1 細菌的檢測

傳統的細菌檢測方法主要是采取培養、生化試驗、病原學檢查等手段進行，但由于其操作煩瑣、檢測時間長、主觀判斷復雜、工作量大以及容易疏忽，難以滿足現代工業對食品中細菌的檢測需求。ELISA 技術在食品安全領域檢測中的應用，可有效對食品中的沙門氏菌、大腸桿菌、軍團菌和金黃色葡萄球菌等細菌進行檢測。以沙門氏菌為例，該細菌是一種常見的食源性致病菌，是食品安全檢測中的關鍵指標。國內外大量研究證實，沙門氏菌已成為引發細菌性食物中毒事件的主要致病菌。1977 年，KRYINSKI 等[6]首次將酶聯免疫吸附檢測法應用在食品中沙門氏菌的檢測，并取得了較好的實驗效果。而后陸續有大量專家利用ELISA 技術對食品中是否含有過量的沙門氏菌開展了研究，但由于他們大多數使用的是多價抗血清，在測試中經常會出現交叉反應，使得測試結果出現假陽性。到20 世紀80 年代，隨著單克隆抗體生產技術的日益成熟，解決了一系列單抗應用中存在的難點問題，形成了抗沙門氏菌的各類O 型抗原、H 型抗原單抗，代替常規血清進行檢測，并體現出ELISA 檢測的優勢性能。

文其乙等[7]利用酶聯免疫吸附技術，選用CB8及De7 兩株單抗相合成酶標檢測試劑，建立了沙門氏菌的高效檢測方法。該方法可以在48 h 內完成對5 CFU/25 g 肉類樣品的快速檢測，敏感性達到99%，特異性達到100%。馬杰華[8]的研究表明，酶聯免疫吸附法可在很大程度上縮短檢測時間，僅需22 h 可實現自動測試。段悅慶等[9]采用夾芯式酶聯免疫吸附法組裝了檢測試劑盒，并對大腸桿菌進行了ELISA 測試，結果顯示，均未與其他菌株發生交叉反應；對雞肉、牛肉等樣本敏感性測試，其檢出限在0.4 ～4.0 CFU·g-1，試劑盒的敏感性、特異性、精密性均達到預期要求。另外，應用酶聯免疫吸附技術還可實現對水果中耐熱細菌的檢測。肖鋼軍等[10]利用酶聯免疫吸附法檢測金黃色葡萄球菌，其檢測周期僅為18 h，檢出率達到1 CFU·g-1。

3.2 真菌毒素的檢測

真菌毒素屬于一種自然界天然存在的有毒化學物質，可在飼料和不同農作物上生長，隨著食物鏈殘留在家禽、肉和牛奶等食品中，不僅對人體具有毒性、致癌、致畸等嚴重危害，而且還對腎臟、肝臟、免疫系統造成不可逆的影響。由于真菌毒素在人體內積累會對身體健康產生嚴重的影響，大部分國家和地區都制定了嚴格的法律法規，對食品中殘留的真菌毒素最高限量進行嚴格控制。常見的食品污染真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、T-2 毒素等，他們主要殘存在小麥、大米、玉米和花生等食品中。

以黃曲霉毒素為例，該毒素是一種由黃曲霉、寄生曲霉等真菌所產生的次生代謝物，主要存在于花生、玉米、乳及乳制品等糧油和動植物食品中，具有極強的致病力和致癌性，國際癌癥研究組織已經把黃曲霉毒素列入全球一類致癌物名錄。早在1977年，WOLTERS 等[11]就開始應用ELISA 技術對黃曲霉毒素進行檢測，利用小分子將黃曲霉毒素B1與蛋白免疫動物結合，成功制備出黃曲霉B1的酶標復合物，為今后黃曲霉毒素檢測提供了重要的理論依據。而后陸續有專家學者不斷效仿，并在此基礎上嘗試新的技術創新。孫清等[12]通過使用牛血清白蛋白、雞卵清蛋白、辣根過氧化物酶等試劑，制得黃曲霉毒素B1免疫原，對食品樣品中的黃曲霉毒素B1進行檢測，成功研制了用于檢測玉米、豆粕和魚粉樣品的高靈敏試劑盒，檢測限可達7.6 pg·mL-1，樣品平均回收率達到108.4%～134.8%。姚靜靜等[13]制備了具有高靈敏度的黃曲霉毒素B1單克隆抗體，并采用ELISA 間接檢測技術對糧食和飼料中是否含有黃曲霉毒素進行檢測，黃曲霉毒素B1單克隆抗體的效價達到5.12×105，檢測范圍在0.014 ～1.920 ng·mL-1，說明該檢測方法具有較強的可靠性。

3.3 食品介導病毒檢測

ELISA 技術還可用來檢測食品中的介導病毒，其主要檢測食品從業人員甲肝、乙肝病毒攜帶等感染情況。目前，已有的文獻資料表明病毒感染與克山病關系密切，尤其以柯薩奇B 組病毒居多。黃漢菊等[14]采用ELISA 技術檢測了四川省30 例患有克山病人的血清，選取非病區10 名人員作為比照，結果表明克山病組血清抗體陽性率明顯高于非病區人員樣本，驗證了潛、慢型克山病患者有柯薩奇B 組病毒感染的存在。

4 結語與展望

在食品微生物檢測中，ELISA 技術作為一種簡單、快速、高效的檢測方法，體現出了其巨大的應用價值，已成為一種新的研究方向。本文結合酶聯免疫吸附技術在食品檢驗中的應用現狀，探討其應用途徑，對于保障人們的食品安全具有一定的借鑒作用。ELISA 技術在食品微生物檢測中具有良好的應用效果，逐漸成為食品領域微生物檢測最有效的分析工具，實現了極低濃度水平下食源性致病菌的檢測，滿足食品安全國家或行業標準中對微生物限量的檢測需求，但目前國內技術還不完善，要積極學習國外先進經驗，以提高檢測結果的準確性，為我國食品安全管理工作提供可靠依據。隨著蛋白質、基因工程等科學水平的不斷發展，抗體的制備技術也將越來越成熟，未來ELISA 的檢測效率將獲得更大的提升。