食品中抗生素抗性基因及檢測技術研究進展

胡燕玲，陳亞波，金倩儀

（中山市食品藥品檢驗所，廣東中山 528400）

抗生素（Antibiotics）是20 世紀醫學研究上的重要發現之一，主要應用于治療和預防疾病、促進機體生長發育等[1]。抗生素屬于抑菌劑，對機體內微生物的生長和代謝活動具有較大的抑制能力，在含量較低的濃度下就可以在某種程度上抑制甚至消滅其他微生物[2]。自抗生素問世后，廣泛被應用于治療人與動植物的疾病，曾被認為是可以治愈任何細菌感染的靈丹妙藥。我國養殖業中抗生素的濫用十分嚴重。調查顯示，2007 年我國抗生素年生產量達到210 000 t，其中46.1%用于畜牧養殖業；2013 年我國生產248 000 t 抗生素，國內使用約162 000 t，其中84 240 t 用于畜禽養殖業，主要用于養豬業與養雞業，磺胺類、大環內酯類、氟喹諾酮類、四環素類、β-內酰胺類及其他抗生素所占比例分別為5%、26%、17%、7%、21%和24%[3-5]。抗生素產生的耐藥性已經是全世界共同面對的問題，從世界衛生組織的數據記載獲知，目前每年全世界感染耐藥性病原微生物的人數達200 萬，有高達14 000 人以上因耐藥菌具有抗生素抗性基因而醫治無效死亡[6]。現階段，我國僅有大型醫院會嚴格控制抗生素的濫用情況，但在食品原料方面，如水產品養殖、畜禽養殖及蔬果種植業中非法使用和添加抗生素的現象仍未得到改善。養殖業中各種添加濫用抗生素的情形尤為突出，促使微生物中抗性基因向更加復雜多樣化的耐藥模式轉變、擴散且持續長久的存在。抗生素抗性基因在人們日常生活環境中持續長時間的存在以及在不同寄主的傳播水平通常比抗生素本身帶來的危害更加嚴重，因此食品中抗生素抗性基因檢測研究已成為食品科學領域新的研究熱點[7]。

1 國內外抗生素抗性基因研究現狀

現有國內外資料記載對抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）的研究重點集中于大自然氣體等環境介質、水質和土壤。LU 等[8]對遼河一帶水質進行研究，發現所有水體中都能檢測到3 種磺胺類耐藥基因，是因為養殖戶在養殖過程中長期使用抗生素，也可能是ARGs 的轉移導致的富集。KERRY 等[9]研究發現養殖池塘中攜帶ARGs的耐藥性菌株種類和數量多于未使用過抗生素的河流。MUZIASARI 等[10]研究的波羅的海漁場海水中抗生素抗性基因污染情況顯示，漁場檢測到豐富的ARGs，盡管漁場中沒有使用氨基糖苷類抗生素，但在農場沉積物中富含氨基糖苷類抗生素的抗性基因，說明水體中ARGs 污染較嚴重。目前在食品領域中對于ARGs 的研究在樣品類型和檢測手段方面都在不斷拓展，研究成果豐碩。

1.1 國內研究發展現狀

近年來食品領域中ARGs 的研究逐漸成為熱點。葉蕾[11]最早以廣州市水產養殖品作為研究對象，通過聚合酶鏈式反應和16S rRNA 測序方法研究水產養殖品中耐藥共生菌的耐藥水平，分析耐藥決定因子和耐藥菌菌體類型，發現505 株多重耐藥細菌中，耐磺胺藥物的sulI 基因以及多重耐藥細菌含有Ⅰ型整合子整合酶基因intI 的約有1/4。其中含耐磺胺藥物sulII 基因的多重耐藥菌占15%，含抗四環素tetE基因的多重耐藥菌占5%。在多重耐藥細菌中的分布比中抗紅霉素耐藥基因ermB、ermC 以及β 內酰胺酶編碼抗性基因blaTEM、blaCMY 的占比分別為1.3%和0.3%及4.5%和1.7%。劉宗保[12]利用熒光定量PCR 對廈門市某養殖場的部分豬肉樣品中的耐藥基因進行定量分析，使用變性梯度凝膠電泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）研究生豬養殖場環境及豬肉樣品的細菌群落結構，使用宏基因組高通量測序的方法分析養殖場土壤中的耐藥基因分布情況。結果表明，豬肉樣品中ARGs 污染嚴重，養殖場土壤中存在大量的耐藥基因，并發現新的耐藥基因。馮淑貞等[13]應用實時熒光定量PCR 技術對采集自內蒙古錫林郭勒牧區的11 份傳統發酵乳制品中常見抗生素抗性基因豐度進行了絕對定量檢測，結果發現22 種常見抗性基因均有檢出。王慧平[14]對ARGs 研究是在總DNA 水平上采用實時熒光定量PCR 技術系統分析ARGs 的污染狀況，樣品來源為市售水產品、蔬果產品、肉制品和某養殖場豬糞便樣品，結果表明各個樣品中均存在一定程度的ARGs污染。超市的污染最低，其次是水產品市場，來自菜市場的水產品及蔬菜樣品抗生素抗性基因污染最為嚴重。食品是ARGs 進入人體的直接載體，因此對各類食品中的抗生素抗性基因進行定量和分布狀況研究有著深遠的意義。蝦類、魚類產品是常見的食材，但水產養殖業普遍濫用抗生素，對人體健康造成了威脅[15]。李娟等[16]選取養殖場周邊農田10 份蔬菜樣品，通過PCR 方法，分析研究了喹諾酮類、氯霉素類、大環內酯類、四環素類和磺胺類等5 類ARGs分布情況。四環素類ARGs 和磺胺類ARGs 殘留最高，且范圍最廣，蔬菜表面、內部檢出率分別為70%和100%。其次是喹諾酮類ARGs，蔬菜表面、內部檢出率分別為100%和60%。結果表明，畜禽養殖場周邊的蔬菜ARGs 污染較為嚴重，可能會導致蔬菜內部細菌產生耐藥性，進而通過食物鏈傳播進入人體。但總體來說，對食品中ARGs 的研究尚缺乏系統性，樣品類型覆蓋面不夠，且研究的技術手段仍局限于PCR 或熒光定量PCR，至今鮮見有采用宏基因組方法研究食品中ARGs 的文獻報道。因此，人們對食品中存在哪些ARGs 尚缺乏深刻的認識。

1.2 國外研究發展現狀

宏基因組學是一種新的基因組學技術，通過提取樣品中全部微生物總DNA，構建基因組文庫，研究全部微生物的基因組，并探究微生物群落結構和功能。宏基因組學具有巨大的應用前景，可用于分析微生物群體的多樣性與豐度、環境中微生物群體基因組成及功能，可用于研究微生物與環境、宿主間的關系，也能在發現具有特定功能的基因以及衡量微生物群落宏基因組表達水平等方面廣泛應用[17-18]。但宏基因組學方法主要應用于環境領域[19-20]。近年來，隨著人們食品安全意識的提高，越來越認識到食品中抗生素抗性基因殘留在人類健康和環境污染等方面的嚴重性。隨著宏基因組學技術的發展，在自然環境、動植物和人體內檢測到越來越多的ARGs，利用宏基因組學技術可以研究存在于不同領域的ARGs，建立完整的宏基因組文庫，也可以研究ARGs 的抗生素耐藥機制與傳播途徑之間的聯系。相比于普通PCR、熒光定量PCR或高通量PCR，利用宏基因組學方法可在更大程度上幫助人們更全面地了解ARGs 在不同環境中的豐度與多樣性變化，對構建或完善現有的宏基因組文庫、研究ARGs 對人們的潛在威脅具有重要意義。但基于高通量測序的宏基因組學方法在食品領域的應用仍較少[21]，特別是在水產品、畜禽產品、發酵食品等食品中ARGs 的研究上尚屬空白。

2 食品中抗生素抗性基因檢測技術研究進展

ARGs 被認定為21 世紀新型污染物，目前針對ARGs 的大多數研究主要集中在土壤、飲用水和生活污水等環境領域，對于食品領域中ARGs 的研究報道不多[22-25]。在當今人們越來越關注食品安全的大環境下，關于食品中抗性基因的豐度研究也應該受到關注。最近的研究顯示，蝦、魚和貝類等水產品中磺胺類、四環素類、氨基糖苷類抗生素抗性基因檢出6 類抗生素抗性基因（tetA、tetB、tetM、sul Ⅱ、floR、aphA-1、aadA、ermB、cmlA）和Ⅰ類整合子5’端整合酶基因intI1、3’端磺胺耐藥基因sul Ⅰ、季銨鹽化合物及溴化乙錠的耐藥基因qacEΔ1[26]；發酵乳制品中檢出tetO、ermB、cat 等22 種常見抗性基因[27]。以上研究結果顯示，由于ARGs 在環境及食物鏈中的基因水平轉移，食品中ARGs 的污染越來越嚴重，需采用更先進的技術全面分析ARGs 的多樣性和豐度。然而目前食品領域ARGs 的檢測分析主要基于熒光定量PCR 技術，該技術單管檢測基因數量少，無法全面高通量地分析樣品中的所有ARGs。采用高通量測序的宏基因組學方法分析食品中ARGs 的研究至今鮮見報道，迫切需要采用高通量技術手段對食品樣品中的ARGs 進行分析，并評價其在食品中的多樣性和豐度。

基因芯片技術在ARGs 檢測中也有一定的應用。基因芯片技術是將數以萬計、甚至百萬計的DNA 探針固定于固相載體上形成DNA 微陣列，將樣品核酸用熒光或同位素等方法標記，通過與芯片探針雜交檢測樣本內的多種特定DNA 序列，通過計算機分析，即可得到樣品中大量基因序列特征和基因表達信息。由于基因芯片進行一次雜交即可獲得樣品中大量序列信息，且具有靈敏、準確、多參數同步分析、高度并行性和快速全自動分析的特點，研究者常將其用于樣品中大量耐藥基因的檢測，研究對象主要是環境樣品，基因芯片技術應用于食品中ARGs 的研究鮮見報道。該技術在實際應用中也存在一些不足之處，主要是由于目前大部分芯片檢測采用熒光染料而非基于探針技術，因此存在基因芯片檢測ARGs時特異性不強等問題。為了更好地發揮基因芯片高通量、快速的檢測優勢，迫切需要根據已知的耐藥基因序列設計出相應的特異性強的探針，從而有效避免假陽性、假陰性以及特異性等問題。而TaqMan 微流體基因芯片（TaqMan Low-Density Arrays，TLDA）技術的出現，為研究食品中ARGs 提供了新的思路。TaqMan 微流體芯片具備384 個微孔反應腔，每個微孔可按需求預先包埋針對特定檢測靶標設計的DNA引物對和對應的TaqMan 探針。采用TaqMan 微流體芯片檢測樣品時，只需加入待檢測樣品的核酸及PCR 預混液配制的溶液即可在一次PCR 擴增過程中，完成多個樣品、多個靶標的檢測。該基因芯片的優點是高通量篩查，多樣品、多基因靶點的同時檢測；單孔單重擴增，避免相互干擾；操作簡便，省時省力，5 min 完成上樣，無需復雜的微量液體移動裝置；標準化程度高，消除系統誤差，利于實驗室間結果比較。由于其采用TaqMan 探針，可以極大提高檢測的準確性。可以預見，微流體基因芯片TaqMan 將會在ARGs 的檢測分析方面發揮積極作用。然而目前未見基于TaqMan 探針的微流體芯片技術應用于食品中ARGs 的研究報道。

3 結語

目前，食品中ARGs 的研究缺乏系統性，且研究手段較為局限，不能全面了解各類食品中ARGs的分布規律。國內外已有一些采用PCR、熒光定量PCR 分析食品中ARGs 的報道，但是對于采用基于高通量測序的宏基因組學和基于TaqMan 探針的基因芯片技術檢測食品中ARGs 的研究尚屬空白，特別是人們對于各類食品中ARGs 的多樣性和豐度以及遷移規律的認識還有待探究。宏基因組學作為近年發展出來的一種新的基因組學技術，通過宏基因組學分析可以全面了解研究對象的基因組成、功能以及微生物群落結構信息。隨著高通量測序技術的發展以及測序成本的降低，該方法在研究基因組成及微生物群落多樣性方面應用越來越廣泛。本研究所涉及的另一技術基因芯片技術，該技術在食品領域應用主要在轉基因檢測和致病菌檢測方面，國內外未見有應用于水產品、畜禽產品、發酵食品等食品中ARGs 的報道。TaqMan 微流體基因芯片（TaqMan Low-Density Arrays，TLDA）技術，對水產品、畜禽產品、蔬菜、發酵食品等樣品中的ARGs 類型、相對豐度、多樣性，同時篩選出上列不同類型樣品中共有及特有的ARGs 保守序列，后續通過TaqMan 微流體芯片等基因芯片方法開發針對性的ARGs 芯片及建立快速ARGs 檢測方法。由于使用TaqMan 探針，相比于其他基因芯片技術，檢測特異性和靈敏度將更具優勢。基于TaqMan 微流體基因芯片技術的ARGs 高通量基因芯片的研發，可為今后食品安全監管、評估市售食品安全性提供重要的技術支撐和保障，無疑在食品中ARGs 研究的深度及廣度方面具有較大的學術價值。