一種阿爾茨海默病大鼠模型的建立*

孟 雪 賈 璞 鄭曉暉 王世祥 駱 晶

(1. 陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，西安 710003)(2. 西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710069)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。我國(guó)每年治療AD患者的直接費(fèi)用和間接費(fèi)用合計(jì)高達(dá)1萬多億元，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。目前，AD發(fā)病機(jī)制尚無定論，病因有β-淀粉樣蛋白異常沉積、膽堿能損傷學(xué)說、Tau蛋白過度磷酸化、氧化應(yīng)激等[2]。復(fù)雜病因使得基于藥物靶標(biāo)的AD西藥研發(fā)進(jìn)展緩慢。因此，中藥復(fù)方多途徑協(xié)同起效，防治AD的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)日益受到重視。良好的病理模型是AD新藥研發(fā)臨床前研究的基礎(chǔ)[3-4]。由于其疾病本身的復(fù)雜性，單一病理因素模擬下的AD動(dòng)物模型無法復(fù)制該病的整體癥狀，越來越多的研究趨向于復(fù)合造模。D-半乳糖(D-gal)可在腦組織中形成淀粉樣斑塊，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞老化、損傷等[5-6]。Anil等[7]報(bào)道，鋁是慢性蓄積性神經(jīng)毒物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明鋁會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)病理、神經(jīng)行為及神經(jīng)化學(xué)的改變，從而導(dǎo)致記憶能力損傷。因此，本研究選擇皮下注射氯化鋁(AlCl3)和腹腔注射D-gal的復(fù)合造模方法，制作一種創(chuàng)傷小、周期短且易操作，但接近真實(shí)病理狀況的AD大鼠模型，通過經(jīng)典Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)水平檢測(cè)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，SPF級(jí)，20只，體質(zhì)量220～240 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境，溫度(21±2)℃、相對(duì)濕度為(50±2)%，明暗交替周期為12 h/12 h，大鼠自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)通過陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所福利倫理審查，審查編號(hào)：CAP2017(A)0029-2019，倫理審查意見第503號(hào)。

1.2 試劑

AlCl3購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，D-gal購(gòu)自Sigma，AchE測(cè)定試劑盒及總蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器

Spectra Max 340PC型酶標(biāo)儀：Molecular Devices；DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。Morris水迷宮：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供，水池為不銹鋼制品，直徑120 cm，高50 cm，水深25 cm，水池內(nèi)壁為黑色，配套有機(jī)玻璃圓形平臺(tái)(直徑12 cm、高20 cm)。水迷宮正上方安裝有攝像機(jī)，連接計(jì)算機(jī)后，可以即時(shí)跟蹤和拍攝大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，并將記錄數(shù)據(jù)發(fā)至電腦系統(tǒng)，圖像自動(dòng)采集系統(tǒng)和SMART2.5.20水迷宮視頻分析軟件：Panlab。

1.4 建立動(dòng)物模型

大鼠隨機(jī)分成正常組和模型組，每組10只。模型組腹腔注射D-gal，給藥劑量60 mg/kg；同時(shí)皮下注射AlCl3水溶液，給藥劑量為100 mg/kg，1次/d，連續(xù)45 d，建立AD大鼠模型。

1.5 行為學(xué)測(cè)試

1.5.1Morris水迷宮適應(yīng)訓(xùn)練：造模完成后，進(jìn)行1 d水迷宮適應(yīng)訓(xùn)練，每只大鼠訓(xùn)練2次。圓形水池被等分為4個(gè)象限，定為1、2、3、4象限，平臺(tái)定為第5象限。大鼠從不同象限入水，如果90 s找不到站臺(tái)，則人為引導(dǎo)至站臺(tái)，停留20 s。每次訓(xùn)練完成后，迅速將大鼠用潔凈毛巾擦拭干凈，輕輕放回籠盒，減少其應(yīng)激反應(yīng)。

1.5.3空間探索實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行4 d的定位航行實(shí)驗(yàn)后，大鼠對(duì)于水迷宮測(cè)試已經(jīng)比較熟悉，所以選擇第5天進(jìn)行大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)。撤除平臺(tái)，選擇原平臺(tái)象限(第4象限)的對(duì)側(cè)象限，即第2象限入水，記錄大鼠在90 s內(nèi)跨越原平臺(tái)(第5象限)的次數(shù)。由軟件系統(tǒng)自動(dòng)分析水迷宮內(nèi)大鼠的航行軌跡，記錄大鼠在第4象限的停留時(shí)間和游泳距離。

1.6 AchE活性檢測(cè)

水迷宮測(cè)試完成后，大鼠處死，取腦組織，冷生理鹽水沖洗，稱質(zhì)量后，以每克組織加入9 mL生理鹽水的比例計(jì)算，冰浴條件下用玻璃勻漿機(jī)充分研磨，將制得的10%腦勻漿液，4 ℃下3 500 r/min離心10 min，吸取上清液。總蛋白含量選取BCA法進(jìn)行，按照蛋白含量測(cè)定試劑盒方法進(jìn)行，計(jì)算出總蛋白含量。AchE檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒測(cè)定方法進(jìn)行。AchE活力值的定義為：(組織蛋白樣本/ng)在37 ℃孵育6 min，水解反應(yīng)體系中1 μmoL基質(zhì)為1個(gè)活力單位。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測(cè)試

2.1.1模型死亡率：模型死亡率為0。

2.1.2定位航行實(shí)驗(yàn)：結(jié)果見表1。第1天，正常組與模型組的潛伏期時(shí)間最長(zhǎng)，隨著天數(shù)增加，兩組大鼠的逃避潛伏期都逐漸縮短，例如：第4天和第3天的逃避潛伏期接近。將兩組每天的潛伏期進(jìn)行比較，模型組均高于正常組(P<0.01)；4 d潛伏期平均值比較發(fā)現(xiàn)，模型組的大鼠潛伏期與正常組比較，差異極顯著(P<0.01)，模型組潛伏期延長(zhǎng)約10 s。

表1 大鼠逃避潛伏期測(cè)定結(jié)果

2.1.3空間探索實(shí)驗(yàn)：結(jié)果見表2，模型組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)僅為2.1次，明顯低于正常組大鼠的5.1次(P<0.01)；模型組大鼠在平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間百分比和距離百分比，分別是(44.87±3.47)%和(42.97±3.91)%，分別高于正常組的(28.09±4.64)%和(29.86±5.91)%，且差異極顯著(P<0.01)。

表2 大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2 AchE活性測(cè)定

大鼠大腦AchE活性測(cè)定結(jié)果見表3。模型組的AchE酶活力升高，與正常組相比，差異極顯著(P<0.01)。

表3 大鼠大腦AchE活力測(cè)定結(jié)果

3 討論

Morris水迷宮是一種檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)考察方法，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精確，對(duì)動(dòng)物損害較小，相比較其他記憶測(cè)試實(shí)驗(yàn)，能系統(tǒng)全面地考驗(yàn)動(dòng)物空間認(rèn)知加工過程[8]。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)；空間探索實(shí)驗(yàn)中，在目標(biāo)象限中游泳距離和時(shí)間延長(zhǎng)，但是穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，與定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，提示模型組動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降。中樞膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，AD患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿神經(jīng)功能明顯下降，乙酰膽堿(Ach)為促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要的神經(jīng)遞質(zhì)，AchE是表征腦膽堿能系統(tǒng)功能完善、良好的重要標(biāo)志酶，其活性變化能間接反映Ach在腦中的變化[9]。本研究中，AD模型大鼠腦內(nèi)AchE活力升高，說明動(dòng)物膽堿能系統(tǒng)功能受損。綜上可知，通過D-gal和AlCl3復(fù)合造模方法復(fù)制AD模型大鼠，能夠復(fù)制AD臨床病理特征，為防治AD中藥新藥臨床前研究提供合格模型動(dòng)物。

AD致病因素較多，針對(duì)各病因建造的動(dòng)物模型也較多[10]。目前，AD病理模型主要有以下幾種：物理方法(如基底核損壞等)、化學(xué)方法(β淀粉樣蛋白注射、D-gal、AlCl3)等損毀病理模型；復(fù)合動(dòng)物模型；快速老化小鼠模型；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等，但是這些模型均有一定不足之處，如Aβ?lián)p害模型，造模時(shí)注射方式會(huì)對(duì)腦組織形成不可逆地穿透損傷，且隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)會(huì)自動(dòng)清除注射的Aβ，無法維持長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)周期。腦是AD疾病的主要病位，某些損毀模型，對(duì)動(dòng)物腦部造成創(chuàng)傷較大，間接干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。快速老化小鼠和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型則較為昂貴，因此制作復(fù)合模型與單因素模型比較而言，更能復(fù)制AD疾病復(fù)雜的臨床病理變化，且造價(jià)較低，對(duì)動(dòng)物損傷小，易于操作造模。

D-gal可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷，從而導(dǎo)致腦部神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、腦內(nèi)正常的生理功能降低，使模型近似于人類自然衰老，產(chǎn)生相近的生理生化功能改變，使得學(xué)習(xí)記憶能力下降[11]。鋁屬于慢性毒物，具有神經(jīng)毒性作用，可導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)和腦內(nèi)淀粉樣斑塊生成[12]。楊坦[13]報(bào)道采取灌胃AlCl3結(jié)合腹腔注射D-gal制作AD模型，但以小鼠為多見，大鼠模型較少。由于中藥復(fù)方多為湯劑口服給藥，長(zhǎng)期灌胃AlCl3對(duì)胃腸刺激可能影響口服藥物的吸收，間接影響藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果。羅紅波等[14]采用灌胃AlCl3和腹腔注射D-gal制作復(fù)合模型大鼠，采取Y-迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，已證實(shí)該造模方法可以促使海馬部位老年斑增多，但未對(duì)膽堿能系統(tǒng)影響進(jìn)行研究。因此，本研究采用Morris水迷宮及腦內(nèi)AchE檢測(cè)對(duì)模型建立成功與否，進(jìn)行行為學(xué)考察和病理指標(biāo)評(píng)價(jià)，進(jìn)一步驗(yàn)證該AD模型合理性。