家兔PICC靜脈化療動物模型血管病理變化研究*

黃利全 陳桂園 胡慶華 胡 波 方露燕

(1. 金華職業技術學院，金華 321017)(2. 金華市中醫院，金華 321017)(3. 金華市人民醫院，金華 3210002)

抗腫瘤藥物的化學治療簡稱化療，是腫瘤患者的三大治療手段之一。通過外周靜脈注射化療藥物時，常致靜脈炎的發生，甚至出現局部皮膚潰瘍、皮下組織壞死及功能障礙等嚴重并發癥。張鹍等[1]研究認為，經外周置入中心靜脈導管(peripherally inserted central catheter，PICC)指由外周靜脈穿刺插管，并使其頭端位于上腔靜脈中下段的中心靜脈導管置入術，上腔靜脈處較大的血流量可迅速稀釋藥物，降低化療藥物對血管壁的刺激，減少化療藥物造成的局部組織紅腫、疼痛或壞死。然而，PICC置管患者容易發生靜脈血栓、靜脈炎、感染等不良反應，影響治療效果，甚至對患者的生命安全構成嚴重威脅[2-3]。由于腫瘤患者存在個體差異、不同的病因、不統一的防護方案、無法截取留置血管進行光鏡觀察等原因，限制了對化療性靜脈損傷的研究。因此，本研究選擇酒石酸長春瑞濱注射液(以下簡稱長春瑞濱)建立PICC靜脈化療動物模型，對化療性靜脈損傷的發生機制和病理反應過程進行實驗研究，以期為腫瘤患者探尋針對PICC相關性靜脈損傷的防護措施。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭大白兔(以下稱實驗兔)48只，體質量1.2～2.5 kg，雌雄各半，雌兔未孕，購自金華市實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(浙)2017-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2016-0008，在金華市食品藥品檢驗檢測研究院進行動物實驗，經金華職業技術學院動物倫理審批，IACUC編號：2019017。實驗兔隨機編號，單籠飼養，按編號排列兔籠。

1.2 主要試劑與儀器

1.9 Fr×50 cm的單腔PICC導管(批號：1901002，優力捷公司)；0.9%氯化鈉溶液(批次：A18122701-1，四川科倫藥業股份有限公司)；酒石酸長春瑞濱注射液(批次：181001，江蘇豪森藥業集團有限公司)。全自動凝血分析儀RAC-030(R01001，20181225,深圳雷杜生命科技)，獸用全自動血液細胞分析儀(型號：BC-2800vet，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)； ELISA試劑盒(SEA029Ra，批次L210311678；SEA569Ra，批次L210322259；SEA079Rb，批次L210224762；SEA073Rb，批次L210323353；SEA821Rb，批次L210223758；CEA506Rb，批次L210323381，武漢云克隆科技股份有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1分組方法：對48只實驗兔進行編號。隨機數字表法，分為第1、2、3、7、14、21、23和24天，n=6，共完成一療程(2個周期)的化療。第一周期為第1～3天，第2天用藥，第二周期為第22～24天，第23天用藥。

1.3.2建模方法：規格為10 mg/mL的酒石酸溶解于10 mL生理鹽水，按Meeh-Rubner氏公式計算家兔體表面積，確定25 mg/m2作為實驗劑量，使用輸液泵緩慢注射15 min，于置管后第2天和第23天各給藥一次。用藥畢，使用肝素鹽水按脈沖式正壓法封管。在化療藥物間歇期，按正規操作完成PICC置管維護，每周更換一次敷料，遇敷貼潮濕或卷邊隨時給予消毒和更換。

1.3.3模型評價方法：評判成功建立PICC動物模型的方法為一次穿刺成功，局部無損傷、滲血，X光透視下確定導管末端無扭曲、折疊，留置在實驗兔前腔靜脈。實驗兔給藥后存活，無嚴重不良反應。

1.3.4標本提取方法：每只實驗兔在相應的時間點，拔除PICC留置管并用外科手術法分別在導管前、后截取兩段(靠耳緣靜脈端為前段、靠前腔靜脈端為后段)，平均每段長約5 cm；同時截取耳緣靜脈與前腔靜脈，每段長約3 cm，共4個活體標本，分別在10%甲醛中固定，8組48只實驗兔共計192個標本。

1.3.5靜脈炎與血栓評價方法：目測觀察8組靜脈炎發生情況。根據聞曲等[4]報道，按照美國靜脈輸液護士學會2011年修訂標準，結合動物實驗特點，去除評價標準中有關疼痛的指標，將靜脈炎分為5個等級：0級，沒有癥狀；Ⅰ級：穿刺部位出現紅斑，伴隨或不伴隨疼痛；Ⅱ級：穿刺部位出現紅斑及疼痛，和/或水腫；Ⅲ級：穿刺部位出現紅斑及疼痛，形成條狀痕或紋，可觸及靜脈索；Ⅳ級：穿刺部位出現紅斑及疼痛，形成條狀痕或紋，可觸及的靜脈索>2.5 cm。光鏡下觀察其病理變化程度，從7個方面判定：①血管腫脹，血管周圍水腫；②炎性細胞浸潤；③管壁增厚；④管腔充血；⑤纖維增生,內皮細胞增生；⑥血管周圍出血；⑦血栓形成。

1.3.6凝血指標與免疫指標監測方法：8組于置管后對應時間分別采集實驗兔PICC管內靜脈血，檢測凝血酶原時間(PT)和血小板計數(PLT)，并采用ELISA法檢測C反應蛋白(CRP)、D-二聚體(D-dimer)、E-選擇素(E-Selectin)、P-選擇素(P-Selectin)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)等含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 PICC化療的靜脈炎與靜脈血栓發生率對比

觀察各組12個靜脈標本以12個PICC導管標本，目測靜脈炎發生率為33.3%共8組，n=6，均為Ⅰ級靜脈炎，實驗組與對照組比較，雖無顯著統計學差異，但明顯可見第7天炎癥達高峰。光鏡觀察靜脈血栓及導管血栓發生率分別為9.38%和31.25%，實驗組與對照組比較無顯著統計學差異，但第21天靜脈血栓與導管血栓均未發生(表1)。

表1 各組實驗兔PICC化療靜脈炎與靜脈血栓發生率比較

2.2 PICC化療的靜脈血管蘇木素-伊紅(HE)染色檢測結果

PICC置管第1天(對照)耳緣靜脈血管內膜不規則破潰和纖維性增生，形成瘢痕，管腔幾乎閉塞，并伴少量出血。前腔靜脈血管內膜不規則破潰，管壁增厚，并伴較多炎性細胞浸潤。實驗組：第2天(首次給藥)耳緣靜脈血管壁輕微破潰，并有少量血栓。前腔靜脈血管內膜不規則破潰、管壁增厚，并伴少量炎性細胞浸潤；第3天耳緣靜脈血管內膜不規則破潰、內膜纖維性增生并無血栓。前腔靜脈血管內膜變化同第2天；第7天耳緣靜脈血管腔內形成瘢痕，管腔未完全閉塞。前腔靜脈血管內膜較完整，管壁略增厚，并伴少量炎性細胞浸潤；第14天耳緣靜脈血管壁輕微破潰，少量血栓，管腔較通暢。前腔靜脈血管內膜較完整，管壁正常，并伴少量炎性細胞浸潤；第21天耳緣靜脈血管較完整，無明顯瘢痕，無血栓形成，管腔通暢。前腔靜脈血管內膜較完整，管壁略增厚，并伴少量炎性細胞浸潤；第23天(再次給藥)耳緣靜脈血管腔內形成瘢痕，管腔未完全閉塞。前腔靜脈血管內膜較完整，管壁略增厚，并伴較多炎性細胞浸潤；第24天耳緣靜脈管腔內無明顯瘢痕及血栓形成。前腔靜脈內膜較完整，管壁正常，并伴少量炎性細胞浸潤(圖1～圖2)。

圖1 各組實驗兔PICC化療的耳緣靜脈HE染色檢測結果

圖2 各組實驗兔PICC化療的前腔靜脈HE染色檢測結果

2.3 PICC化療的導管HE染色檢測結果

PICC置管第1天(對照)、第2天(首次給藥)及第23天(再次給藥)導管內均有血栓，并充滿管腔。第3天導管內有血栓，占部分管腔。第7、14、21及24天導管內均無血栓(圖3)。

圖3 各組實驗兔PICC化療的導管HE染色檢測結果

2.4 PICC化療的凝血指標監測結果

7組實驗兔PICC化療血清中的PLT、PT及D-dimer含量各組間比較，以及與對照組比較，差異極顯著(P<0.001，圖4)。

圖4 各組實驗兔PICC化療的凝血指標監測結果比較

2.5 PICC化療的免疫指標監測結果

實驗兔PICC化療血清中，CRP、E-Selectin、P-Selectin、IL-2及IL-6含量各組間比較，并與對照組比較，差異極顯著(P<0.001，圖5)。

圖5 各組實驗兔PICC化療的免疫指標監測結果比較

3 討論

本研究發現PICC置管引起的靜脈炎發生率為33.3%，靜脈血栓發生率為9.38%，與李俊英[5]和王紅等[6]分別報道的17%～32.3%(靜脈炎)以及26.67%(靜脈血栓)有差異。推測本研究靜脈炎較高發生率可能與以下因素有關：(1)穿刺PICC置管過程中導管尖端錯位或血管損傷，引起血管內膜受損；(2)留置導管致局部血流緩慢；(3)導管屬機體異物,較快就被血漿蛋白與纖維蛋白包圍，血小板聚集；(4)給藥后引起血管內膜損傷等。炎癥反應在留置PICC管后1 d便出現，第3天(給藥后1 d)炎癥加重，第7天炎癥達高峰，第14天仍有小幅升高，直到第21天降至正常水平。這種靜脈炎癥高峰期后移以及炎癥消退時間延后的現象，與王紅等[7]報道的24 h出現靜脈炎癥反應，48 h最顯著，約于1周恢復的時間有差異。推測產生以上差異的原因，除了PICC置管所致的物理性損傷外，主要與長春瑞濱刺激血管內皮細胞、血小板或嗜酸性粒細胞，致組織因子釋放，靜脈血管損傷有關，還與靜脈血栓形成有關，如圖1所示，第2天靜脈管腔已出現血栓，第7天血栓基本已波及整個血管壁，直至第21天血管壁內膜完整、管腔光滑及血管損傷基本修復。可見一個化療周期的兩個療程間歇時間安排較為合理。

本研究發現導管血栓的發生率為31.25%，明顯高于靜脈血栓的發生率，分析原因可能與導管內徑較小，血流量較小及血流速度較慢有關。兩次用藥后，實驗兔血液內PLT明顯下降、PT縮短及D-dimer時間明顯延長，提示PICC置管及使用化療藥物后，家兔處于高凝狀態。Maemura等[8]和羅丹鳳等[9]研究表明，因長春瑞濱屬長春花堿類衍生物，該藥對微管蛋白具有較高的親和力，故能起到阻止微管蛋白聚合及誘發微管解聚等作用，達到抑制腫瘤細胞復制、分裂及增殖的目的，該藥骨髓抑制程度較重，血小板減少明顯[10]。Haas等[11]證實，該藥致血管內皮損傷，內皮細胞表面凝血酶調節蛋白(TM)及內皮細胞蛋白C受體(EPCR)表達降低，蛋白C的活化受損，抗原提呈細胞(APC)活性減低，引起內皮細胞(VEG)促凝及抗凝活性的平衡失調；也可引起血漿蛋白C和游離蛋白S水平下降，增加纖溶酶原激活物抑制劑PAI1水平，從而產生高凝狀態。同時，PICC置管產生的機械性刺激，加重損傷血管內皮細胞，增加組織因子的產生，促進凝血功能。周平等[12]研究提示，靜脈血栓高發風險為D-dimer時間延長，這與本實驗研究結果相符。D-dimer時間延長，可能與置管穿刺操作及化療藥物對血管造成刺激和損傷有關，經同時激活纖溶系統和凝血系統，實驗兔在PICC置管第2天、第3天以及第23天家兔的D-dimer時間延長明顯。

宋云霄等[13]發現，CRP與IL-6在使用化療藥物后第2天和第23天升高明顯，停藥5 d后降至較低水平。CRP主要用于感染性疾病的診斷，可反映機體的免疫功能和炎癥水平，可與IL-6相互作用，引起炎性細胞浸潤。IL-6屬于具有多種免疫調節功能的一種前炎性細胞因子[14-15]，如升高說明機體處于炎癥反應期。結合本實驗，實驗兔兩次給藥后，CRP與IL-6明顯升高，提示化療藥物對血管內膜的刺激，導致靜脈炎的發生。

本實驗還分別測定了PICC置管后各時間點的E-Selectin和P-Selectin含量，E-Selectin在用藥后升高，但隨之小幅下降；P-Selectin含量在置管第3天達峰值。Krause等[16]和Silva等[17]報道，E-Selectin和P-Selectin作為一類重要的細胞黏附分子，在微血管和骨組織中恒定表達，當機體遭遇炎癥損傷或腫瘤侵犯時，體內的E-Selectin和P-Selectin表達便會上調，介導層流條件下的白細胞在血管內皮細胞上的滾動及黏附。因此，本實驗提示實驗兔PICC置管早期，二者可能介導了炎癥細胞遷移、黏附，參與了靜脈損傷后修復的病理過程。其中，P-Selectin在血栓形成過程中起始動作用，使血小板與中性粒細胞黏附、聚集并形成血栓，上調單核細胞表達組織因子，進一步引起止血異常，導致單核細胞在損傷的血管內皮滾動與聚集，激活炎癥細胞引起局部炎癥反應，進一步損傷血管內皮功能。

IL-2主要由經充分活化的TH1細胞產生，屬人體內一種非常重要的免疫調節因子，不僅可對T細胞分泌淋巴因子過程產生刺激和活化作用，參與到免疫調節機制中，且還可使T淋巴細胞、自然殺傷細胞及單核細胞的細胞毒活性得到顯著性提升[18-20]。本實驗發現，IL-2在使用化療藥物后，呈下降趨勢，在第21天達峰值，說明實驗兔使用長春瑞濱后，抑制TH1細胞分泌IL-2，致機體免疫力下降，經化療間歇期的調整后，基本恢復正常。

綜上，本研究在通過建立PICC化療藥物動物模型,檢測不同時間點血液內凝血指標與免疫指標的含量及變化規律，探討炎癥反應的可能機制及病理變化，有助于理解各指標在血管損傷修復過程中的作用，為今后采用各指標特性進行PICC化療靜脈并發癥的防護研究提供依據與思路。