苯甲酰芍藥苷通過Nrf2/HO-1通路對心肌梗死大鼠心功能的影響作用機制研究

余 莉 鄔 洋

(武漢市中醫醫院二橋分院心血管內科，武漢 430000)

現階段，急性心肌梗死(AMI)仍然是全世界范圍內導致死亡的主要原因之一[1]。氧化應激反應和細胞凋亡在AMI后損傷的病理演變過程中占有重要地位，在早期急性缺血中，血液供應不足會引起氧化應激反應，進而誘導心肌細胞凋亡，改善氧化應激反應和抑制急性心肌缺血后的細胞凋亡是治療AMI的主要策略[2-3]。根據雷斌等[4]報道，核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1(Nrf2/HO-1)通路是調節氧化應激的關鍵通路，在AMI中發揮重要作用，但是目前尚無治療AMI的特效藥物。近年來中藥在治療AMI中取得了重要進展，赤芍是毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血、活血祛瘀的功效，可有效治療冠心病及其并發癥[5]。苯甲酰芍藥苷(benzoylpaeoniflorin,BA)是赤芍的有效活性成分，具有調控氧化應激的功能[6-7]。最新研究顯示芍藥苷可以緩解腦缺血再灌注損傷引起的大鼠腦組織細胞凋亡[8]。本研究主要分析BA通過Nrf2/HO-1通路對AMI大鼠心功能的影響和作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑和材料

成年SPF級的SD大鼠，雄性，220～250 g，購自成都達碩生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2019-17。本研究相關實驗已通過武漢市中醫醫院實驗動物福利倫理審查，編號：WHTCMLLDW2019-017。BA(吉林大學藥物化學研究室)、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、ELISA試劑盒及TUNEL凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，酶標儀(Model 680，Bio-Rad)，RIPA裂解緩沖液(Beyotime)，BCA蛋白測定試劑盒(Applygen)，抗體(Abcam)，PVDF膜(Bio-Rad)。小動物超聲成像儀(麟得科學儀器有限公司)，BX-42光學顯微鏡(Olympus)。

1.2 動物分組、建模和干預

36只SD大鼠隨機分為三組(n=12)：Sham組、AMI組和AMI+BA組。AMI組和AMI+BA組大鼠建立AMI模型[9]。AMI模型建造方法簡述如下，通過腹腔注射1%戊巴比妥(3 mL/kg)麻醉大鼠，麻醉后連接心電圖，使用剪刀小心剪開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約 2 mm處的冠狀動脈前降支結扎。此時心電圖顯示大鼠心電圖顯示QRS波增寬，提示結扎成功，繼續結扎30 min后取出絲線進行再灌注，然后縫合胸腔。術后使用抗生素進行抗感染干預，注射8萬U的青霉素，2次/d，持續3 d。Sham組打開胸腔暴露心臟但不結扎，縫合胸腔后注射青霉素。建模后AMI+BA組大鼠使用BA灌胃，170 mg/kg，1次/d，連續7 d，在第8 天進行后續檢測。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1心功能指標：大鼠通過檢查心電圖后連接超聲成像儀進行心臟超聲檢查，根據儀器說明書檢測左室射血分數(LVEF)，以及左室內壓力最大變化率(±dp/dtmax)。

1.3.2心肌酶指標：采集大鼠尾靜脈血液樣本，將血液樣本離心收集上層血清(2 000 r/min、20 min)。然后使用ELISA試劑盒檢測肌酸激酶MB(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)，根據制造商說明書加入抗體，然后通過酶標儀檢測吸光度，然后根據標準曲線計算濃度。

1.3.3HE染色：大鼠處死后取出心臟，將心肌組織經過梯度乙醇脫水、透明處理后石蠟包埋，冷凍后切成4 μm厚切片，再將切片脫蠟并再水化。使用3%的過氧化氫(H2O2)甲醇溶液封閉內源性過氧化物酶活性。使用蒸鍋在95 ℃、0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中對切片進行熱誘導的抗原回收。通過HE染色試劑盒觀察心肌組織病變情況。

1.3.4TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡：將心肌組織經石蠟包埋后切成4 μm厚的切片，然后去石蠟、水化，使用蛋白酶K溶液消化15 min，洗滌。將切片與H2O2-PBS緩沖液在室溫下孵育15 min，并用PBS洗滌3次，每次5 min。按照試劑盒說明加入染色試劑，然后進行反染色。顯微鏡下隨機選擇5個視野，呈現深棕色的細胞計為凋亡細胞，凋亡率(%)=(染色陽性細胞數目/視野中總細胞數目)×100%。

1.3.5Western blot：將心肌組織研磨，使用RIPA裂解緩沖液裂解，使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V、90 min)，然后將蛋白轉移到PVDF膜上(50 V、120 min)，在含有5%脫脂牛奶的封閉溶液中封閉，而后將PDVF膜與anti-Nrf2和anti-HO-1(1∶500稀釋)在4 ℃孵育過夜，加入HRP偶聯二抗(1∶5 000稀釋)在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內參對蛋白條帶的灰度進行定量。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較

AMI 組大鼠 LVEF、±dp/dtmax和-dp/dtmax顯著低于Sham 組(P<0.05)，AMI+BA組LVEF、±dp/dtmax和-dp/dtmax顯著高于AMI組(P<0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠LVEF和±dp/dtmax比較

2.2 各組大鼠心肌酶指標比較

AMI+BA組CK-MB和LDH顯著低于AMI組(P<0.05)，見表2。

表2 各組CK-MB和LDH水平比較

2.3 心肌HE染色結果

Sham組心肌細胞形態正常，且排解緊密。AMI組心肌細胞形排列紊亂，并出現炎性浸潤和細胞丟失。AMI+BA組心肌細胞形態基本正常，排列基本正常，細胞丟失顯著減少，見圖1。

圖1 HE染色檢測心肌組織損傷情況(×400)

2.4 各組心肌細胞凋亡情況比較

如圖2所示，藍色為細胞核，染色為深棕色的即為凋亡細胞。AMI組的凋亡率(13.08±1.23)%顯著高于Sham組(1.14±0.10)%，P<0.05，AMI+BA組心肌細胞凋亡率(6.43±0.78)%顯著低于AMI組，P<0.05。

圖2 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況(×400)

2.5 各組Nrf2/HO-1通路水平比較

與Sham組比較，AMI組Nrf2/HO-1水平顯著降低(P<0.05)，AMI+BA組Nrf2和HO-1水平顯著高于AMI組，見表3和圖3。

表3 各組Nrf2/HO-1蛋白水平比較

圖3 Western blot檢測Nrf2/HO-1通路中蛋白水平

3 討論

心肌組織的急性心肌缺血會導致氧自由基等活性氧物質的產生增加，并引起有害細胞信號的激活，從而促進內皮細胞的炎性細胞因子和趨化因子的表達，導致炎癥細胞向缺血的心肌區域浸潤，引起心肌損傷。另一方面，高水平的活性氧自由基和炎性因子也會促進心肌細胞凋亡，而心肌組織梗死區和附近的心肌細胞死亡會進一步促進剩余健康心肌的重塑，進而引起左心室重塑引起纖維化和左心室擴張，影響功能，嚴重時會導致心力衰竭。抑制AMI后的心肌細胞凋亡，增加存活心肌細胞的數量是減少心肌損傷維持AMI后正常心功能的重要途徑[10]。

在中藥理論中，赤芍具有散瘀止痛、清熱涼血及活血化瘀之功效，過往有研究顯示赤芍具有保護心肌缺血再灌注損傷的作用[11]。赤芍也對心肌缺血有治療效果[12]。BA是赤芍中重要的活性物質[13]，并且具有抑制氧化應激反應和炎性反應的作用，而這是AMI后主要的病理改變[14-15]。本研究通過結扎的方法建立大鼠AMI模型，并采用BA灌胃干預，結果顯示在干預7 d后，AMI組LVEF和(±dp/dtmax)顯著降低，其中LVEF降至50%以下，心功能明顯受損，并且HE染色結果顯示心肌細胞受損和丟失。經過BA干預后，大鼠LVEF和(±dp/dtmax)恢復，提示心功能恢復較好，并且HE染色顯示細胞丟失顯著減少。這提示BA可顯著地減少心肌細胞損傷，從而促進AMI后心功能的恢復。

凋亡是細胞死亡的一種獨特形式，心肌細胞凋亡是AMI后的重要特征，是急性缺血階段心肌細胞減少的重要原因，研究顯示在AMI的初期(0～7 d)，心肌細胞凋亡優先于細胞壞死，并且細胞凋亡數目是決定最終梗死面積的主要影響因素[16]。抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡可能會改善左心室重構，從而改善心臟功能[17]。Nrf2/HO-1通路具有調節凋亡的作用，可通過調節氧化應激或炎性反應的方式，或直接調控心肌細胞的凋亡[18]。Zhao等[19]的研究結果也顯示高糖誘導的心肌細胞凋亡與Nrf2/HO-1通路有關。本研究結果顯示，AMI建模7 d后，Nrf2/HO-1通路受到抑制心肌細胞凋亡顯著增多，而BA可上調Nrf2/HO-1的水平，緩解心肌細胞的凋亡情況。此外，有研究顯示BA具有通過上調Nrf2/HO-1水平以緩解小鼠氧化應激的作用[20]。在脊髓損傷的大鼠模型中，BA也可以通過調節Nrf2氧化應激通路減輕癥狀[21]。這提示BA可能通過上調Nrf2/HO-1通路，抑制AMI大鼠的心肌細胞凋亡。

綜上所述，BA通過上調Nrf2/HO-1通路從而抑制AMI模型大鼠的心肌細胞凋亡，并發揮保護心功能的作用。關于BA對AMI的影響以及調控Nrf2/HO-1通路的機制仍需要進一步研究。