MNV感染對乙肝疫苗效價評價的影響*

李曉波 王淑菁 付 瑞 王莎莎 秦 驍 李 威 黃宗文 賀爭鳴 王 吉 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

實驗動物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)，廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)、畜牧等領(lǐng)域，實驗動物質(zhì)量會直接影響到科學(xué)實驗結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，關(guān)系著產(chǎn)品質(zhì)量和人民群眾的身體健康。生物制品質(zhì)量問題牽扯著人民大眾的神經(jīng)，是關(guān)系國計民生的大事，關(guān)乎國家的長治久安，而生物制品質(zhì)量評價需要大量的動物實驗，因此必須重視實驗動物的質(zhì)量問題，實驗動物微生物的預(yù)防與控制就顯得尤為緊迫和重要。

小鼠諾如病毒(murine norovirus,MNV)是目前實驗小鼠中感染率最高的病毒[1-2]，國際上一些知名的實驗動物監(jiān)管和檢測機(jī)構(gòu)如歐洲實驗動物聯(lián)合會(FELASA)[3]、Charles River實驗室等已將其列為實驗小鼠的常規(guī)檢測項目，盡管我國已出臺了MNV的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，但不具有強(qiáng)制性，而實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)目前還未要求實驗小鼠排除MNV，因此我國大多數(shù)的實驗動物生產(chǎn)和使用單位都未對其進(jìn)行控制，因此，造成很多實驗使用的小鼠是MNV陽性鼠。

已有報道MNV對巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有感染親嗜性，并能夠感染B細(xì)胞[4-5]，感染免疫細(xì)胞的特性表明MNV可能會對免疫相關(guān)的實驗造成影響。小鼠可通過發(fā)揮固有免疫及適應(yīng)性免疫功能抗MNV感染，根據(jù)李曉波[6]研究表明MNV感染會影響小鼠的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致T細(xì)胞、B細(xì)胞含量及細(xì)胞因子含量發(fā)生顯著改變。因此，MNV的感染極有可能會影響生物制品的質(zhì)量評價，而目前這方面的研究尚處于空白。

乙肝疫苗為國家計劃內(nèi)疫苗(一類疫苗)，其質(zhì)量把控至關(guān)重要，乙肝疫苗的檢驗依據(jù)《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版第三部進(jìn)行，其中規(guī)定用NIH或BALB/c小鼠來測定重組乙肝疫苗(CHO細(xì)胞)的效價，本研究參照《中國藥典》乙肝疫苗效價測定方法，選用BALB/c小鼠為實驗對象，研究MNV的感染對乙肝疫苗效價測定的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1病毒株:小鼠諾如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，本實驗室分離并保存[7]，TCID50為10-5.330/0.1 mL。

1.1.2實驗動物:SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量8～10 g，雌性，共120只，購自國家嚙齒類實驗動物種子中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2017-0005，經(jīng)檢測符合SPF等級實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)且MNV為陰性。動物實驗于中國食品藥品檢定研究院屏障動物設(shè)施進(jìn)行，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0013，實驗所用鼠料、水、墊料等均經(jīng)滅菌處理，已通過中檢院實驗動物福利倫理審查委員會審查，中檢動(福)第2018(B)020號，按實驗動物的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑和儀器

重組乙型肝炎疫苗(CHO細(xì)胞，規(guī)格：20 μg/支，批號：201707YB06)為華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒(規(guī)格：96人份，批號：201709181)購自上?？迫A生物工程股份有限公司。酶標(biāo)儀(Thermo，型號MK3)。

1.3 方法

1.3.1動物分組：動物隨機(jī)分為感染組和對照組，每組60只，感染組經(jīng)口灌胃0.2 mL MNV病毒液，對照組灌胃0.2 mL生理鹽水。

1.3.2乙肝疫苗的免疫：小鼠感染MNV后第7天免疫乙肝疫苗，感染組和對照組均分為乙肝疫苗高劑量組(1.25 μg/mL)、中劑量組(0.31 μg/mL)和低劑量組(0.078 μg/mL)，每組20只，每只腹腔注射乙肝疫苗1 mL。于免疫后第7、14、21、28及35天分別經(jīng)眼周靜脈采血，分離血清。

1.3.3乙肝表面抗體(HbsAb)的檢測：用乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒定性檢測HbsAb，按說明書操作進(jìn)行，每份樣本測兩次。

1.3.4結(jié)果的計算與分析：①計算半數(shù)動物有效劑量(ED50)：分別計算感染組和對照組各免疫時間點的ED50值，具體為統(tǒng)計各劑量組乙肝疫苗免疫后HbsAb陰陽性動物數(shù)量，計算距離比例=高于50%陽轉(zhuǎn)率-50/高于50%陽轉(zhuǎn)率- 低于50%陽轉(zhuǎn)率，計算50%陽轉(zhuǎn)終點對數(shù)=高于50%陽轉(zhuǎn)率稀釋對數(shù)+距離比例×稀釋對數(shù)的因數(shù)，計算稀釋度=1050%陽轉(zhuǎn)終點對數(shù)，計算ED50=原濃度(20 μg/ml)/稀釋度；②統(tǒng)計分析：采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，t檢驗比較對照組與感染組總體ED50均值；卡方檢驗比較對照組與感染組總體HbsAb結(jié)果及各時間點、各劑量組的HbsAb結(jié)果，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ED50比較

由于免疫第7天HbsAb陽轉(zhuǎn)率較低，無法計算其ED50。比較對照組和感染組各時間點ED50的總體均值，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；對比兩組各時間點的ED50值可見，除了免疫后第21天兩組的值接近，其余3個時間點感染組的ED50值均高于對照組(表1)。

表1 對照組及感染組ED50值比較(μg/mL)

2.2 HbsAb陽性率比較

2.2.1總體陽性率比較:對照組與感染組各免疫時間點HbsAb總體陰陽性結(jié)果見表2，經(jīng)卡方檢驗，兩組HbsAb陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表2 對照組及感染組總體HbsAb結(jié)果比較

2.2.2各時間點兩組HbsAb陽性率比較：分別比較免疫后各時間點兩組之間HbsAb陽性率，經(jīng)卡方檢驗，免疫乙肝疫苗后第7、14、21、28、35天感染組和對照組HbsAb陽性率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，表3)。

表3 不同時間點對照組及感染組HbsAb結(jié)果比較

2.2.3不同劑量組兩組小鼠HbsAb陽性率比較:由于低劑量組HbsAb結(jié)果均為陰性，未對其進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。經(jīng)卡方檢驗，乙肝疫苗免疫后第28天及第35天，對照組小鼠免疫高劑量乙肝疫苗產(chǎn)生HbsAb的動物數(shù)量顯著高于感染組(MNV陽性組)(P<0.05)；疫苗免疫后第14天，對照組小鼠免疫中劑量乙肝疫苗產(chǎn)生HbsAb的動物數(shù)量相比感染組(MNV陽性組)有顯著提高(P<0.05)，其余各時間點未見統(tǒng)計學(xué)差異(表4)。

表4 各免疫劑量組內(nèi)對照組及感染組HbsAb比較

3 討論

《中國藥典》2015年版第三部規(guī)定乙肝疫苗接種4～6周后采血，測定乙肝表面抗體，本實驗選擇在乙肝疫苗接種后第1～5周共5個時間點采血，對每個時間點的免疫效果分別進(jìn)行比較，以更全面的評估MNV感染對乙肝疫苗效價測定的影響。實驗的設(shè)計遵循實驗動物福利的3R原則，使用盡量少的動物得到所需要的數(shù)據(jù)，每個劑量免疫20只，對小鼠進(jìn)行少量多次采血，每次采血控制在小鼠循環(huán)血量的10%以內(nèi)，大約100～200 μL，對動物的損傷較輕，并且保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。對結(jié)果進(jìn)行“定量”和“定性”的比較，“定量”指比較ED50，“定性”比較HbsAb的陰陽性結(jié)果。

從已有研究來看，目前還未有MNV的不同感染劑量會影響實驗結(jié)果的報道。參考文獻(xiàn)報道的方法[8-9]，本研究采用經(jīng)口灌胃的方式和單一的攻毒劑量感染小鼠，但病毒的感染劑量仍是影響實驗結(jié)果不可忽視的因素，針對MNV的不同感染劑量對乙肝疫苗質(zhì)量評價結(jié)果影響的問題，還需后續(xù)的實驗進(jìn)行深入研究。按照《中國藥典》2015年版第三部中規(guī)定的乙肝疫苗效價測定方法，需將乙肝疫苗濃度設(shè)為高、中、低3個劑量組來免疫小鼠，再根據(jù)每個劑量組的免疫結(jié)果來計算疫苗的半數(shù)動物有效劑量(ED50)。本研究在實驗的每個時間節(jié)點均通過采集糞便的方式對小鼠的MNV進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果顯示整個實驗周期感染組小鼠MNV均為陽性，對照組均為陰性，確保了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

MNV感染對生物制品檢定的影響，目前國內(nèi)外均無相關(guān)的報道。盡管比較對照組和感染組所有時間點ED50的總體均值、兩組HbsAb的總體陽性率及每個時間點HbsAb的陽性率，均未發(fā)現(xiàn)存在顯著差異，但進(jìn)一步比較各劑量組的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在免疫第14天，中劑量乙肝疫苗免疫對照組小鼠產(chǎn)生HbsAb的動物數(shù)量顯著高于感染組；免疫第28天及第35天，高劑量疫苗免疫對照組小鼠產(chǎn)生HbsAb的動物數(shù)量均顯著高于感染組。各時間點的ED50值相比，除了免疫第21天，其余時間點的ED50值對照組均低于感染組。藥典規(guī)定的采血時間點是免疫后第28天～第42天，而實驗結(jié)果表明這段時間兩組的結(jié)果會出現(xiàn)差異。以上結(jié)果表明使用MNV感染的小鼠來評價乙肝疫苗會導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，所測的乙肝疫苗效價有可能低于MNV陰性小鼠。

MNV對巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有感染親嗜性[4-5]，而巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在動物機(jī)體的免疫應(yīng)答過程發(fā)揮著十分重要的作用，樹突狀細(xì)胞負(fù)責(zé)抗原遞呈和加工，可促進(jìn)T細(xì)胞活化，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生B細(xì)胞刺激因子，促使B細(xì)胞分泌免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)，從而參與B細(xì)胞的生長、分化與抗體產(chǎn)生[10-11]。推測MNV感染導(dǎo)致乙肝疫苗效價測定值偏低主要有以下兩點原因：一是病理方面因素：乙肝疫苗效價測定使用的是BALB/c小鼠，病理研究發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠脾發(fā)生的病理變化主要表現(xiàn)為脾小結(jié)數(shù)量的減少[12]，脾小結(jié)位于脾白髓中央動脈周圍淋巴鞘的旁側(cè)，為B細(xì)胞區(qū)，脾小結(jié)數(shù)量減少意味著淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少，動物免疫力的降低；另一個原因是MNV感染造成的小鼠免疫功能的改變，輔助性T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞，兩種細(xì)胞之間通過分泌細(xì)胞因子，彼此交叉調(diào)節(jié)又互相抑制。我們先前報道的免疫指標(biāo)變化研究中，MNV感染導(dǎo)致BALB/c小鼠γ干擾素(IFN-γ)含量顯著升高[6]，而IFN-γ作為Th1的效應(yīng)分子，具有輔助細(xì)胞免疫的作用，同時其高表達(dá)對Th2細(xì)胞的增殖分化又產(chǎn)生了抑制，而Th2細(xì)胞起輔助體液免疫的作用，因此間接影響到了小鼠的體液免疫應(yīng)答。根據(jù)以上兩點原因推測MNV感染影響了小鼠的體液免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響到乙肝疫苗效價測定的結(jié)果。

本研究在MNV感染第7天進(jìn)行免疫，屬于感染的急性期，慢性期免疫(感染30 d后)是否同樣會對乙肝疫苗效價的測定產(chǎn)生影響？先進(jìn)行乙肝疫苗的免疫再感染MNV，以及免疫后的不同時間感染會產(chǎn)生什么影響？要進(jìn)一步深入了解MNV感染對乙肝疫苗的影響，這些問題都有待后續(xù)進(jìn)行深入研究。

致謝：感謝中檢院肝炎室邱少輝等同事提供的幫助！