連續流動分析儀測定水溶肥料硝態氮

李亞麗 孔令娥 劉 蜜 汪 洪* 蘇志明

(1.中國農業科學院 農業資源與農業區劃研究所，北京 100081； 2.國家化肥質量檢驗檢測中心(北京)，北京 100081； 3.農業農村部農產品質量安全肥料源性因子風險評估實驗室(北京)，北京 100081； 4.中國合格評定國家認可委員會，北京 100081)

水溶肥料中氮養分形態主要有銨態氮、硝態氮和尿素態氮，養分高、水溶性好，適合現代農業生產，節水、省肥、高效，廣泛用于各種糧食、蔬菜、果樹等經濟作物，發展迅猛，但目前尚未見對水溶肥料中硝態氮含量及其檢測方法單獨作出規定[1-3]。

目前，肥料中硝態氮的測定方法有重量法、分光光度法、離子色譜法、高效液相色譜法、拉曼光譜法等[4-5]。國家標準《肥料中硝態氮含量的測定氮試劑重量法》(GB/T 3597—2002)規定了肥料中硝態氮含量的測定方法為氮試劑重量法，適用于各種肥料中硝態氮含量的測定，但當9倍于氮含量的過量氯化物存在時，測定結果偏高，且操作步驟煩瑣，測試時間長，檢驗過程中容易引起誤差，造成測定結果的重現性較差。農業行業標準《肥料硝態氮、銨態氮、酰胺態氮含量的測定》(NY/T 1116—2014)規定了紫外分光光度法測定肥料中硝態氮含量，適用于硝態氮含量較低的樣品，當試樣中硝態氮濃度過高時，試樣可能因稀釋倍數較大，導致測定結果誤差偏大。離子色譜法、高效液相色譜法、拉曼光譜法等方法靈敏度高，穩定性好，但成本較高，分離步驟較為復雜，肥料中可能含有的Cl-、SO42-、PO43-等與NO3-共存的陰離子對NO3-產生一定的影響[6]。

連續流動分析儀法是采用空氣片段連續流動分析技術，將試樣溶液和試劑在一個連續流動的系統中均勻混合[7]，在硫酸銅作催化劑的堿性溶液中，用聯氨將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與磺胺和對氨基苯磺酰胺及 N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，簡稱NEDD)反應生成粉紅色絡合物，在波長550 nm處測定其吸光度，其吸光度大小與硝酸根離子濃度成正比，從而測定硝態氮含量。連續流動分析儀法采用自動化分析，人為因素干擾較小，精度高、重現性好、能大幅度提高分析速度，更適用于批量樣品的分析，廣泛應用于土壤[8]、水體[9]中硝態氮的測定，但有關肥料中硝態氮的測定還不多見。本文選擇6個不同的水溶肥料樣品，探討利用連續流動分析儀測定其中硝態氮的含量，將其測定結果與紫外分光光度法測定結果進行對比分析，以為生產和科研中硝態氮的測定提供參考。

1 實驗部分

1.1 試樣制備

試驗樣品選取了含腐植酸水溶肥料、有機水溶肥料、微量元素水溶肥料、大量元素水溶肥料4類，樣品6個，其中固體樣品2個，液體樣品4個，分別編號為S1，L2，L3，L4，S5，L6。固體樣品縮分至約100 g，將其迅速研磨至全部通過0.50 mm孔徑實驗篩，混合均勻，置于潔凈、干燥容器中；液體樣品經多次搖動后，迅速取出約100 mL，置于潔凈、干燥容器中。

1.2 儀器設備

AutoAnaLyzer 3連續流動分析儀(SeaLAnaLyticaLGmbh)；UV-2501PC紫外分光光度計(SHIMEDZU)；Y JY-2112F振蕩器(恒宇分析儀器有限公司)；XS105 DU分析天平(感量為0.000 1 g，METTLER TOLEDO)。

1.3 主要試劑

鹽酸溶液(1+1)、實驗用水均為三級水。

硝態氮標準溶液(2.5 g/L)：準確稱取9.022 5 g 于 120 ℃干燥至恒重的硝酸鉀于50 mL燒杯中，用水溶解后移入500 mL容量瓶中，定容，混勻，備用。

顯色劑：稱取10 g磺胺、0.5 g NEDD 溶解于600 mL蒸餾水中，待完全混合后，加入100 mL磷酸，并用蒸餾水定容至1 000 mL，混勻，用棕色試劑瓶避光儲存。

氫氧化鈉試劑：將10 g氫氧化鈉溶于600 mL蒸餾水中，加入3 mL磷酸，完全混合后，用蒸餾水定容至1 000 mL，再加1 mL Brij-35助化劑(進口表面活性劑，潤滑泵管)混合均勻。保持溶液清潔，可持續使用。

硫酸肼試劑：在600 mL蒸餾水中分別加入10 mL硫酸銅溶液(1 g/L)、10 mL硫酸鋅溶液(10 g/L)和2 g硫酸肼，定容至1 000 mL。每周制備新鮮試劑。

1.4 樣品浸提

稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g)于250 mL容量瓶中，加入25 mL水和25 mL鹽酸溶液(1+1)，混合，靜置至無氣體放出。加入約100 mL水，在振蕩器上振蕩30 min(振蕩頻率以容量瓶內試樣能自由翻動即可)。加水定容，混勻，干過濾，待測。

1.5 測定

浸提液直接或稀釋后注入連續流動分析儀自動進樣系統。連續流動分析儀測定試樣中硝態氮的原理是在堿性條件下，NO3-—N 被硫酸肼還原成NO2-—N，然后與對氨基苯磺酰胺生成重氮鹽，再與N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(NEDD)偶聯生成粉紅色的化合物，測定吸光值。流動分析儀設置進樣速率30樣/h，蠕動泵泵速25 r/min，進樣與清洗比為 3.0∶1，進樣時間90 s，清洗時間30 s。儀器默認設置基線和漂移校正，自動基線參比為 4%；比色濾光片波長為550 nm，燈強度大于 l 000 mV。

紫外分光光度計測定硝態氮原理是利用硝酸根發色團在紫外區210 nm附近有明顯吸收且吸光度與硝酸根離子濃度成正比的特性，測定硝態氮含量。測定使用1 cm比色皿，以0 mg/L為標準溶液調零，將浸提液稀釋至合適濃度，上機測定。

2 結果與討論

2.1 顯色劑的穩定時間

硫酸肼作為還原劑將NO3-—N還原成NO2-—N，然后與顯色劑反應生成粉紅色的化合物。實驗中發現，硫酸肼放置一段時間后，會影響顯色效果，使得標準曲線相關性差，故對其在放置不同時間的還原能力進行驗證。用不同放置時間的硫酸肼測定標準曲線，其結果如表1所示。結果表明，硫酸肼在放置過程中，其還原能力會逐漸下降，因此適宜的線性范圍最高濃度會逐漸減小，所以標準曲線線性相關系數R2值下降，測定的準確度降低。因此，最好使用冷藏保存未超過7 d的硫酸肼。

表1 硫酸肼不同放置時間測定NO3-—N的 測定結果

2.2 泵速優化

連續流動分析儀測定試樣中硝態氮可使試樣溶液與試劑在管路內充分混合反應，但其導致檢測時間較長，為了提高實驗效率，本實驗對泵速進行了優化。保持其他測定條件不變，分別設置泵速為 10、12、15、20、25、30 r/min，依次測定硝態氮的濃度為200 mg/L標準溶液的吸光度。結果表明，隨著泵速增大，吸光度顯著提高，當泵速達到 25 r/min 時，吸光度信號最強，之后趨于平緩。

2.3 進樣時間的優化

在保證完全反應的基礎上，逐步縮短進樣時間，以吸光度峰高穩定為最佳的進樣時間。分別設置進樣時間為 20、40、60、80、100、120 s，依次測定硝態氮的濃度為200 mg/L標準溶液的吸光度。結果表明，隨著進樣時間的延長，峰高不斷提高，在 80 s 后峰高逐漸趨于平緩(圖1)。

圖1 進樣時間與峰高關系曲線Figure 1 Correlation curve between injection time and peak height.

2.4 標準工作曲線的測定

選擇硝態氮的濃度分別為0、25、50、100、200 mg/L，儀器測定的信號值峰高與標準溶液 NO3-—N濃度之間進行線性回歸，制作校準曲線如圖2示，0～200 mg/L范圍內標準工作曲線的回歸方程為y=300.97x+3853.4，R2=0.9992，滿足測定需要。

圖2 硝態氮含量測定標準曲線Figure 2 Standard curve for determination of nitrate nitrogen content.

2.5 檢出限

檢出限的計算方法是用空白試劑進行多次(n>10)測定，測得數據如圖3所示。根據國際純粹與應用化學聯合會(IUPAC)檢出限測定方法[10]，計算空白溶液測定結果的標準方差SD，并根據標準計算出檢出限MLD=3×SD，可得連續流動分析儀法的儀器檢出限為0.032 mg/L，按照稱取試樣1.000 0 g溶于250 mL容量瓶計算，方法檢出限為0.008 g/kg。

圖3 空白溶液硝態氮含量結果Figure 3 Results of nitrate nitrogen content in blank solution.

2.6 方法的精密度實驗

選擇水溶肥料樣品S1、S2、S3、S4、S5、S6，開展平行重復實驗，每個樣品做6組平行，依次利用連續流動分析儀測出相應的硝態氮(NO3-—N)濃度，測定結果如表2所示。結果表明，測定結果相對標準偏差(RSD，n=6)在1.7%～8.3%，未出現較大偏差。

表2 連續流動分析儀測定結果

2.7 加標回收實驗

向6個水溶肥料試樣中加入一定量的硝態氮(NO3-—N)標準溶液，利用連續流動分析儀進行回收率的測定，計算加標回收率，測定結果如表3所示。結果表明，加標回收率在93.2%～101%，表明該方法準確度較好。

表3 回收率測定結果

2.8 樣品測定與方法比較

6個試樣分別進行6個平行浸提，浸提液分別利用連續流動分析儀法和紫外分光光度法對其中硝態氮(NO3-—N)進行測定，分別得到36個測定數據(圖4)。兩種方法測定硝態氮(NO3-—N)含量范圍分別為0.01%～13.06%和0.03%～12.79%。t檢驗的雙尾P值小于 0.05(表4)，表明兩種方法測定結果之間無顯著性差異[11]。

2.9 相關性分析

將紫外分光光度法和連續流動分析儀的測定結果進行相關性分析(圖5)。兩種方法測定數據之間擬合方程為y=0.9782x+0.0768，R2=0.9966，其中x為連續流動分析儀測定硝態氮含量，y為紫外分光光度計測定硝態氮含量，兩種方法的測定結果之間呈現較好的一致性。

圖4 連續流動分析儀法與紫外分光光度法 測定肥料樣品中硝態氮(NO3-—N)結果比較Figure 4 Comparison of the results of continuous flow analyzer method and ultraviolet spectrophotometric method for determination of nitrate nitrogen (NO3-—N) in fertilizer samples.

表4 t檢驗-成對雙樣本均值比較分析連續流動 分析儀法與紫外分光光度法測定結果

圖5 不同方法測定硝態氮含量之間相關性分析Figure 5 Correlation analysis between different methods of determining nitrate nitrogen content.

3 結論

利用連續流動分析儀在波長550 nm處測定水溶肥料中硝態氮的含量。從標準曲線可以看出，流動分析儀法有很好的線性關系。通過對硫酸肼和顯色劑的穩定時間、泵速、進樣時間等實驗條件進行優化，選取了最佳檢測條件，提高了檢測效率。同時測定結果表明，檢出限為0.032 mg/L，方法檢出限為0.008 g/kg，回收率在93.3%～101%，符合正常的分析范圍，說明本實驗具有一定的準確度；測定結果的相對標準偏差在1.7%～8.3%，符合正常分析范圍，說明本實驗具有一定的精密度；所得數據與紫外分光光度計測定結果對比分析，t檢驗結果表明兩種方法無顯著差異，兩種方法測定數據之間擬合方程為y=0.9782x+0.0768，R2=0.9966，線性相關性較高。

綜上所述，采用連續流動分析儀法測定水溶肥料中硝態氮的方法是可行的。此方法由電腦控制進行進樣測定，分析速度快，消耗試劑少，準確度與精確度較高，適用于大批量的水溶肥料樣品硝態氮含量的測定。