梯度淋洗離子色譜法同時測定西蘭花中6種無機陰離子

高 健 范寶莉 亢原彬 李 煜 李玉梅 尚云濤*

(1.天津師范大學，天津 300387；2.西南林業大學，昆明 650224； 3.天津渤海望亞涂料有限公司，天津 301735)

西蘭花是十字花科蕓薹屬重要經濟作物，是我國人民餐桌上常見蔬菜，并廣泛種植于我國大部分地區如華北、中東部及東南沿海等。西蘭花營養成分豐富，富含多種抗氧化物質、各類維生素、微量元素、膳食纖維及硫代葡萄糖苷等對人體健康有益的生物活性物質[1]。

西蘭花中各種離子成分較為豐富。據報道，人體硝酸鹽總攝入量中蔬菜類食物所占比例較高[2]。研究表明，大量食用高硝酸鹽含量的蔬菜，可能導致胃癌、腸癌等惡性腫瘤發生率提高[3]。而人體攝入的硝酸鹽還可能在一定條件下被還原為危害性更強的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽的氧化性較硝酸鹽強，如過量攝入可能會嚴重影響紅細胞供氧能力，甚至威脅生命[4]。亞硝酸鹽還是強致癌物亞硝胺的前體物質，現已證實亞硝胺是多種癌癥的重要誘發因素[5]。在我國農業生產中，廣泛存在過量施用氮肥以達到增產目的，而大量施用的氮肥又直接導致了農產品中硝酸鹽含量升高[6]。而農產品采收后的儲藏、處理、運輸等環節也可能使其中的硝酸鹽含量升高。而十字花科類蔬菜因其特有的對氮元素吸收轉化特性，使得其農產品中硝酸鹽含量可能較高[7]。西蘭花作為重要的十字花科蔬菜，其硝酸鹽和亞硝酸鹽等無機陰離子含量受到廣泛關注[8]。因此，建立一種西蘭花中各類無機陰離子的定量分析方法，將可以為完善蔬菜食品安全檢測及質量控制提供檢測方法和技術。

據報道，氯離子、硝酸鹽、亞硝酸鹽、溴離子、硫酸鹽、磷酸鹽等無機陰離子的分析檢測技術有分光光度法[9]、電感耦合等離子體質譜法和離子色譜法[10]等。其中離子色譜法因其在定量分析、檢出限、分析效率等方面所具有的顯著優勢，已在各類食品無機陰離子定性定量分析中得到廣泛應用。李倩等[11]以KOH(30 mmol/L)為流動相，建立了同時檢測果蔬中5種陰離子的方法。魯廣秋等[12]建立了超聲波輔助提取-離子色譜法檢測不同產區臭靈丹中4種無機陰離子含量的方法，檢測結果準確可靠，分析效率高。魏泉增等[13]建立以碳酸鈉溶液(3.6 mmol/L)為淋洗液同時檢測茶葉中4種無機陰離子的方法，以高效、精確分析紅茶、綠茶中陰離子含量。目前，在食品檢測領域利用離子色譜梯度淋洗技術分析肉制品和香腸中的亞硝酸鹽和硝酸鹽并取得了理想的檢測效果[14]。植物樣品中離子成分較為復雜，且含量差異較大，在等度淋洗條件下樣品中某些高含量離子組份可能會對其他離子的定量分析產生嚴重干擾。本研究采用梯度淋洗技術以有效提高各離子組份檢測靈敏度，改善定量分析準確性，實驗結果較為理想。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

本研究所用西蘭花均采購自農貿市場或超市。

KCl、Na2SO4、NaNO3、NaNO2、NaBr、Na3PO4均為基準試劑，甲醇(色譜純)；固相萃取小柱(C18，500 mg，3 mL)，超純水電阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設備

DIONEX ICS-2100型離子色譜儀、Supelco固相萃取儀、Milli-Q超純水機。

1.3 離子色譜分析體系

DIONEX Ion Pac AS11-HC(4 mm×250 mm)分析柱，DIONEX Ion Pac AG11(4 mm×50 mm)保護柱，4 mm AERS 500自動再生抑制器，淋洗液流速1.0 mL/min，抑制器電流80 mA，25 μL定量環，KOH淋洗液在線發生器，淋洗液濃度梯度見表1，電導檢測器，柱溫箱溫度30 ℃。

表1 梯度淋洗程序

1.4 標準溶液制備

精確稱取KCl、Na2SO4、NaNO3、NaNO2、NaBr、Na3PO4配制系列混合標準溶液。

1.5 樣品前處理

稱取20 g(精確至0.001 g)西蘭花，洗凈、破碎，加30 mL超純水研磨后定容至250 mL，超聲頻率20 kHz、超聲功率120 W，輔助提取15 min，再經10 000 r/min 離心15 min，取離心后上清液經0.45 μm濾膜過濾，收集濾液。C18固相萃取小柱加入10 mL甲醇、10 mL超純水活化，靜置15 min。將濾液以2～3 mL/min流速通過C18固相萃取小柱，舍棄最初洗脫的約3 mL洗脫液，收集剩余洗脫液后再次經0.45 μm濾膜過濾進行色譜分析。

2 結果與分析

2.1 色譜分析條件

離子色譜梯度淋洗液分離體系進行優化后最終確定淋洗液梯度程序如表1所示，流速為1.0 mL/min，抑制器電流80 mA為最適KOH梯度分析體系。實驗結果表明，該體系下6種無機陰離子色譜峰峰形較好，各組份間分離度高、干擾少，定量分析準確度高(圖1、2)。

圖1 6種無機陰離子標準溶液離子色譜圖Figure 1 Ion chromatogram of 6 inorganic anions standard solution.

2.2 抑制器電流的選擇

抑制器作為離子色譜重要模塊可以顯著降低背景電導，提到檢測靈敏度。抑制器電流過低會導致背景電導升高，影響定量分析的精確性。而抑制器電流過高時雖可以達到較為理想的背景電導抑制效果，但可能降低抑制器壽命，增加檢測成本。本實驗對離子色譜抑制器電流進行了優化，重點考察了抑制器電流50～100 mA條件下系統背景電導值，當抑制器電流過低時系統背景電導明顯上升，當抑制器電流過高時背景電導趨于平衡，過高的抑制器電流并沒有起到更好的抑制效果。本實驗最終確定80 mA為最適抑制器電流，其在梯度淋洗濃度變化條件下有效降低背景電導值(見表2)，提升檢測靈敏度，又對抑制器有一定的保護作用，延長使用壽命。

圖2 西蘭花樣品離子色譜圖Figure 2 Ion chromatogram of broccoli sample.

表2 不同抑制器電流下背景電導變化范圍

2.3 亞硝酸鹽痕量分析

在采用等度淋洗離子色譜法分析亞硝酸鹽時，往往由于氯離子與亞硝酸鹽保留時間較為接近，兩者分離度較小，容易影響亞硝酸鹽檢測靈敏度。又因為蔬菜樣品中氯離子含量通常顯著高于亞硝酸鹽含量，造成亞硝酸鹽色譜峰極易被氯離子色譜峰遮蔽，影響亞硝酸鹽定量分析結果，甚至無法有效檢測亞硝酸鹽含量。

實驗通過構建離子色譜KOH梯度淋洗技術，提高了硝酸鹽及亞硝酸鹽檢測靈敏度。對比常規等度淋洗離子色譜法(KOH淋洗液濃度為30 mmol/L)，如圖3所示，當氯離子與亞硝酸鹽濃度比為1∶100時亞硝酸鹽色譜峰峰形受到嚴重影響(圖3A)，檢測靈敏度降低，無法達到基線分離標準，此時亞硝酸鹽定量分析可能存在較大誤差；當氯離子與亞硝酸鹽濃度比為1∶1000時，氯離子色譜峰甚至完全覆蓋亞硝酸鹽離子色譜峰(圖3B)，出現假陰性檢測結果。而采用梯度淋洗離子色譜法，如圖4所示，氯離子色譜峰與亞硝酸鹽色譜峰分離效果明顯改善，當氯離子與亞硝酸鹽濃度比達到1∶1000，氯離子與亞硝酸鹽分離效果較為理想(圖4A)，當氯離子與亞硝酸鹽濃度比達到1∶10000時，亞硝酸鹽仍可以達到基線分離標準，且峰形及分離度均較好(圖4B)，可見梯度淋洗法將顯著提升亞硝酸鹽檢測靈敏度。

圖3 等度淋洗法亞硝酸鹽離子色譜圖Figure 3 Equi-elution ion chromatogram of nitrite in broccoli.

圖4 梯度淋洗法亞硝酸鹽離子色譜圖Figure 4 Gradient elution ion chromatogram of nitrite in broccoli.

2.4 線性范圍及檢出限

根據6種陰離子系列標準溶液測試結果，以各陰離子組分峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標建立線性回歸方程，計算3倍信噪比作為各陰離子組分檢出限(見表3)。結果表明，6種陰離子組分線性相關系數為0.999 5～0.999 9，檢出限為0.021～0.036 mg/L，結果較為理想。

2.5 色譜體系驗證

將西蘭花樣品平行測試5次，結果顯示6種無機陰離子保留時間及峰面積相對標準偏差(RSD)均小于1.5%；將5份西蘭花樣品分別處理后上機檢測，結果顯示6種無機陰離子保留時間及峰面積相對標準偏差RSD均小于2.5%。結果表明，該色譜體系精密度及重復性均較好。

將3份西蘭花樣品處理后分別添加一定濃度的陰離子標樣，分別檢測樣品本底值和檢測值，計算并檢驗方法回收率。6種無機陰離子回收率范圍95.7%～104%，回收率檢驗效果理想(見表4)。

表3 線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限

表4 樣品加標回收實驗

3 討論

本研究采用梯度淋洗離子色譜法，首先在最初的20.0 min內KOH濃度為7 mmol/L，使氯離子等保留較弱的組分在這一階段被充分洗脫分離，而其他中強保留組分仍然保留在色譜柱中；而后在20.1 min時KOH濃度立刻上升至30 mmol/L，使中強保留組份得到良好分離。同時，淋洗液KOH濃度的梯度變化可以有效降低在等度淋洗條件下可能出現的亞硝酸鹽與氯離子的共洗脫效應，提高了亞硝酸鹽與氯離子的分離度，避免了高濃度氯離子對亞硝酸鹽離子的遮蔽和干擾。西蘭花中含有比較豐富的多種化學和生物活性物質，如蛋白質、脂肪、糖類、維生素、色素、有機酸以及多種有機硫化合物等物質。如果不經過適當的樣品前處理直接進行色譜分析，則極易對離子色譜柱、抑制器、檢測器等重要儀器模塊造成污染，直接影響分析準確性，降低儀器及耗材使用壽命。本研究選用固相萃取小柱(C18)對西蘭花樣品進行凈化處理，減少了各類有機物、色素等物質對檢測結果可能產生的影響，同時又保證了較為理想的回收率，在一定程度上延長了色譜柱和抑制器的使用壽命，降低設備維護成本。

4 結論

建立了一種利用梯度淋洗離子色譜技術分析西蘭花中6種無機陰離子的檢測方法。采用KOH梯度淋洗技術，提高了各組份檢測靈敏度、檢出限低、峰形對稱性好、能夠實現陰離子痕量分析、分析效率高、可以滿足西蘭花中多種無機陰離子高效、精確檢測需求。