酶消解-單顆粒電感耦合等離子體質譜法測定農產品中納米鉑顆粒

劉 欣 劉天豪 羅 琳 譚鑫源 彭宇晴 王 強 杜實之 周耀渝* 楊 遠*

(1.湖南農業大學 資源環境學院，長沙 410128； 2.中南大學 化學化工學院，水環境與農產品安全湖南省重點實驗室，長沙 410083)

納米技術作為21世紀經濟發展的主要驅動力之一，開拓了廣闊的市場空間，巨大的市場需求驅動著各種新型納米材料研發、投入、生產及使用。據報道，當前已有超過1 800多種納米材料應用在人們日常生活和生產中，其中應用最多的是金屬納米顆粒(Metallic nanoparticle，MNPs)，所占比例約為37%[1]。在眾多種類的MNPs中，PtNPs是一種商業化應用較為廣泛的納米材料。目前已廣泛應用于汽車尾氣催化劑、硝酸生產、腫瘤醫藥和生化傳感器等領域，各種新興的納米材料在環境中的積累可能會給人類生活健康帶來影響[2]。研究已證實PtNPs釋放進入到環境中。汽車尾氣催化劑的鉑排放量主要以顆粒形式排放，顆粒大小從25 nm到300 nm不等[3]。研究人員在城市公路塵土、路邊土壤、植被及沉積物等環境介質中均已檢測到高含量Pt元素。以PtNPs為主的MNPs正通過污泥回用、污水灌溉、化肥和農藥施用、大氣沉降、工廠排放、固體廢棄物填埋等途徑進入到農用灌溉水中農田土壤中。水土環境中PtNPs被農作物吸收、累積，并通過食物鏈放大傳遞給人類，對人體健康造成潛在威脅。

闡釋PtNPs等MNPs在農作物體內的吸收、轉運和生物累積規律和特征，對于客觀評價農產品金屬納米毒性效應至關重要[4]。因此，開發可靠的農產品中高靈敏度MNPs快速分析技術是非常有必要的。由于PtNPs具有超細尺寸的特性，其在植物體內中定量分析及顆粒分布不能應用傳統無機元素分析方法(如ICP-MS、ICP-OES或AAS等)[5-6]。與常規污染物相比，PtNPs的表征應是多參數的表征，不僅需表征PtNPs的成分和濃度，還應考慮對PtNPs的特性進行表征(如粒度分布、顆粒組成和納米顆粒濃度等)。傳統表征納米顆粒的技術如動態光散射(DLS)、納米追蹤技術(NTA)和電子顯微鏡(EM)由于其靈敏度較低(檢出限一般為mg/L級別)，難以應用于實際環境樣品中MNPs的表征。目前流場分離(FFF)、毛細管電泳(CE)、流動色譜(HDC)和反相色譜(RP-HPLC)等分離手段通常與ICP-MS聯用，均可用于MNPs的表征[7]。另一方面，單顆粒-電感耦合等離子體質譜法(Single particle ICP-MS，SP-ICP-MS)是近年來發展起來的一種表征環境樣品中低濃度金屬基納米顆粒的高靈敏度分析方法[8-11]。該方法能夠同時提供MNPs 粒徑分布、納米顆粒濃度和納米顆粒質量濃度等信息，該方法的檢出限可達到亞ng/L級別，為農產品中MNPs的準確測定提供了可行性。

將水體中MNPs定量分析技術應用在植物介質仍具有挑戰性。植物組織中MNPs分析的難點在于需保證植物組織中提取出 MNPs的自有性質(如粒徑、形貌等)不發生變化，而且需要高靈敏度的技術對MNPs進行表征。酶消解技術能夠在適宜的穩定及溫和的pH值下將復雜基體中MNPs進行分離。研究人員通過優化不同植物介質中 MNPs 的提取條件，采用 Macerozyme R-10 酶已成功提取植物樣品中MNPs(如AgNPs、AuNPs 和TiO2NPs等)[12-15]。

因此，本研究通過優化酶消解參數，采用酶消解技術將農產品中PtNPs釋放出來，結合SP-ICP-MS技術，建立了農產品中PtNPs定量分析方法，為研究農產品中PtNPs的納米風險評估提供可靠的分析方法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

實驗試劑：尺寸為30 nm和50 nm的PtNPs懸浮液(以濃度為2 mol/L的檸檬酸溶液為介質，由美國NanoComposix公司提供)，通過TEM及DLS表征證明了PtNPs懸浮液的多分散性，PtNPs通過TEM方法檢測到的尺寸分別為：(30.6±3.1) nm和(46±5) nm，PtNPs的質量濃度均為0.05 mg/mL，其納米顆粒數量濃度分別為1.8×1011個/mL(30 nm PtNPs)和4.7×1010個/mL(50 nm PtNPs)；Pt(Ⅳ)標準溶液(濃度為1 000 mg/L)，Pt(Ⅳ)標準溶液配制濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、2 μg/L(1%HNO3介質，使用時現配現用)；60 nm AuNPs(0.05 mg/mL，2 mmol/L檸檬酸介質，美國NanoComposix公司)用于測定單顆粒模式下該方法傳輸效率；為了獲得高靈敏度和低雙電荷數(<2%)，1 μg/L ICP-MS調諧液(Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U，PE公司，1% HNO3介質)用于調諧儀器的最佳狀態。

1.2 儀器

NexION 300 X ICP-MS(PerkinElmer公司，美國)，同心霧化器(PerkinElmer，美國)，液氬(純度>99.99%)，高純水(Ultrapure water，UP水，成都優普，電阻率>18.2 MΩ·cm)；NexION 300 X ICP-MS儀器操作見表1。

數據采集及處理軟件：SyngistixTMNano Application Software Module (PerkinElmer公司，美國)。

表1 SP-ICP-MS儀器參數

1.3 樣品制備及測定

1)農產品中PtNPs的提取

準確稱量0.025 0 g農產品于15 mL離心管中，移取 8 mL檸檬酸緩沖液(5 mmol/L，pH=4.5)，搖勻，冰水浴中超聲5 min，加入0.01 g Macerozyme R-10酶，然后再加入2 mL的超純水，在37 ℃下恒溫振蕩24 h。水浴好的樣品取出靜置，用移液槍取20 μL上清液注入15 mL離心管中并加入超純水定容至15 mL，搖勻，將樣品稀釋至一定倍數后，上ICP-MS測定(SP-ICP-MS模式)。

2)樣品制備及測定

為避免兩個或多個納米顆粒進入等離子體，納米顆粒信號個數小于總信號個數的10%。為減少樣品受進樣系統影響，測量的每個樣品之間采用1%HNO3溶液沖洗，以保證進樣系統中無樣品殘留。在測樣過程中，每測完10個樣品，以100 ng/L 50 nm PtNPs標準品溶液來監控儀器信號是否有明顯漂移。

2 結果與討論

2.1 SP-ICP-MS表征PtNPs標準溶液

依據SP-ICP-MS測定MNPs顆粒原理[9]，采用SP-ICP-MS技術測定了30 nm和50 nm PtNPs稀溶液中Pt顆粒平均粒徑及顆粒濃度，實驗結果見表2。SP-ICP-MS測定PtNPs(30 nm和50 nm)平均粒徑結果與TEM 值(生產廠商提供)接近，顆粒濃度回收率較高，這說明SP-ICP-MS法能夠定量測定稀溶液中PtNPs，這為農產品中PtNPs定量分析提供可靠的分析手段。

2.2 Macerozyme R-10酶對納米鉑顆粒的影響

Macerozyme R-10是一種多組分酶[含纖維素酶(0.1單位/mg)、半纖維素酶(0.25單位/mg)和果膠酶(0.5單位/mg)]，是植物組織中重要組成部分。目前以Macerozyme R-10為主的酶消解技術能夠在保證MNPs的自有性質(如粒徑、形貌等)在萃取過程中不發生變化的前提下將復雜組織基體中MNPs進行釋放[13]。

表2 SP-ICP-MS法測定納米鉑標準溶液粒度分布

因此，在本研究中，為考察R-10酶對PtNPs是否存在聚集/溶解現象，選取納米顆粒濃度8.51×104particle/mL 50 nm PtNPs為分析對象，考察R-10酶添加前后PtNPs溶液的粒徑分布及納米顆粒數濃度的變化。實驗結果表明(見圖1)，由50 nm PtNPs的粒徑分布圖可知，酶處理前后PtNPs無明顯團聚/溶解。R-10酶處理的PtNPs的顆粒濃度為7.60×104particle/mL，與未經酶處理的PtNPs的顆粒數濃度(8.51×104particle/mL)相近，其回收率為89.30%。這說明當R-10酶與PtNPs相互作用時不會引起PtNPs的團聚或溶解，R-10酶用于植物組織中提取PtNPs是可行的。

圖1 50 nm PtNPs溶液(a)及酶處理后50 nm PtNPs溶液(b)的粒徑分布圖Figure 1 The particle size distribution for PtNPs stock suspension (a) and enzyme-treated PtNPs solution (b).

2.3 R-10酶對農產品中PtNPs提取條件的優化

據報道，酶消解技術能夠在溫和的pH值下將復雜基體中MNPs進行分離，通過優化不同植物介質中MNPs的提取條件，研究人員采用酶消解法(Macerozyme R-10)已成功提取了植物樣品中AgNPs、AuNPs和TiO2NPs等，并運用SP-ICP-MS技術對一些植物中MNPs進行定量分析。

因此，本實驗以生菜作為一種典型的農產品，考察了影響酶提取農產品中PtNPs的主要因素，包括酶用量、提取液濃度、水浴時間等，以獲得較高濃度的鉑納米顆粒，同時保證在提取過程中不引起PtNPs顆粒形貌和粒徑發生變化。

2.3.1 R-10酶用量

在酶消解實驗中，酶用量是影響提取農產品中MNPs回收率的重要因素。據報道，10 mg R-10酶可有效地將25 mg農產品中AgNPs、AuNPs和TiO2NPs提取出來。因此，分別稱取5、10、20 mg R-10酶加入到農產品中，加入10 μL 50 nm PtNPs(濃度為50 ng/L)至農產品，再進行酶提取實驗步驟。通過考察提取后PtNPs平均粒徑、頻數、顆粒數濃度和回收率等結果，考察不同量R-10酶對農產品中PtNPs提取的影響。表3為不同量R-10酶提取農產品中PtNPs結果。雖然20 mg R-10酶可獲得最好的PtNPs回收率90.8%±3.2%，但添加10 mg R-10酶的PtNPs顆粒也可獲得良好的PtNPs回收率89.4%±2.3%，接近90%。因此，本實驗以R-10酶添加量10 mg作為樣品前處理的條件。

表3 不同量R-10提取農產品中PtNPs影響

2.3.2 緩沖液濃度

溫和的pH值是保證R-10酶在植物中MNPs提取的前提條件。因此，本實驗分別采用了檸檬酸、醋酸銨和MES緩沖液考察R-10酶對植物中PtNPs影響。研究表明(數據未顯示)檸檬酸鹽體系除了能有效地保證PtNPs從植物中釋放，還能夠保證其形貌和自有屬性基本不發生變化。因此，將檸檬酸體系作為后續的實驗體系。考察檸檬酸(0.5～5 mmol/L)對農產品中PtNPs提取的影響，如圖2所示，隨著檸檬酸濃度的增加，農產品中PtNPs提取效率逐漸提高，當檸檬酸緩沖溶液濃度為5 mmol/L時，PtNPs的提取效率最好，可達92.5%±0.8%。因此，檸檬酸濃度參數選擇為5 mmol/L。

圖2 不同檸檬酸濃度對農產品 PtNPs的提取影響(n=3)Figure 2 Effect of citrate buffer concentration for the extraction of PtNPs from agricultural products (n=3).

2.3.3 水浴平衡時間

在樣品納米顆粒的提取過程中，酶處理溫度和平衡時間可能會影響目標物質中納米顆粒的提取效率。通過參考制造商提供的信息，R-10酶最佳的提取溫度為37 ℃。因此，實驗直接選擇37 ℃為植物中PtNPs的最佳提取溫度。另一方面，通過改變水浴時間(5～36 h)，討論水浴時間對PtNPs的提取影響。由圖3可知，當水浴時間為5～10 h時，PtNPs提取率較低，約為20%。隨著時間增加，PtNPs提取效率逐漸增加，當水浴時間為36 h時，PtNPs提取效率為92.5%±0.8%。因此，選擇36 h為PtNPs提取的最佳水浴平衡時間。

2.3.4 提取參數對農產品中PtNPs提取的粒徑影響

農產品中PtNPs的定量分析除需考慮MNPs能否有效地從農產品中釋放出，還需考慮MNPs在提取過程中尺寸粒徑是否發生變化。分別考察檸檬酸緩沖液濃度(0.5～5 mmol/L)與水浴時間(4～36 h)對農產品中PtNPs平均粒徑的影響。由圖4可知，低濃度檸檬酸濃度更容易引起PtNPs團聚，當檸檬酸濃度為5 mmol/L、水浴時間為36 h時，PtNPs平均粒徑與標準的PtNPs(Control PtNPs)樣品更接近。圖5為優化條件后農產品PtNPs粒徑分布圖。由圖5可以看出，經過R-10酶釋放出PtNPs粒徑分布并未發生明顯的團聚/分解現象。結合之前的PtNPs提取效率研究結果，最終選定R-10酶濃度為10 mg、檸檬酸濃度5 mmol/L、提取時間36 h為最優的農產品中PtNPs參數。

圖3 水浴平衡時間對農產品PtNPs的提取影響(n=3)Figure 3 Effect of equilibrium time for the extraction of PtNPs from agricultural products (n=3).

圖4 不同水浴時間與檸檬酸濃度處理后的 鉑納米平均粒徑(n=3)Figure 4 Average particle size of platinum nanoparticles treated with different concentration of citric acid and water bath time (n=3).

圖5 PtNPs粒徑分布圖 (a)參數優化后農產品中提取PtNPs (b)50 nm PtNPs標準溶液Figure 5 Size distribution of PtNPs (a) PtNPs extracted from agricultural products with optimized parameters (b) 50 nm PtNPs standard solution.

2.4 鉑納米顆粒粒度和濃度檢出限

粒度分布檢出限(LODsize)和顆粒濃度檢出限(LODd)是SP-ICP-MS模式下考察農產品中PtNPs兩個重要參數。農產品中PtNPs粒度分布檢出限(LODsize)可認為是Pt納米顆粒信號與背景信號及Pt離子態信號區分可通過Pt平均背景信號值與5倍標準偏差之和的迭代運算獲得。采用本方法，農產品中PtNPs的LODsize為20 nm。而農產品中PtNPs的LODNP則與三個納米粒子計數的能力相關，可表示為：

因此，SP-ICP-MS法測定農產品中PtNPs顆粒濃度檢出限為5×105particle/L。一般情況下為獲取準確的PtNPs顆粒濃度，測定時建議將樣品測定濃度高于檢出限的5～10倍。

2.5 酶消解-SP-ICP-MS測定農產品中PtNPs

將得到最優條件的酶消解實驗用于生菜、水稻和白菜三種農產品中PtNPs的提取并進行SP-ICP-MS分析，表4中記錄了各項測定指標結果。50 nm PtNPs標準溶液的顆粒直徑為(46±5) nm，而實測樣品PtNPs顆粒尺寸為(43±7) nm。水稻、生菜和白菜加標后PtNPs顆粒數濃度回收率分別為(87±6)%、(81±3)%和(91±4)%，相對標準偏差分別為3.3%、4.0%和7.0%。水稻、生菜和白菜加標后PtNPs顆粒平均粒徑分別為(41±3)、(44±5)和(47±2) nm，相對標準偏差分別為4.5%、7.4%和10.5%。以上結果表明經過條件優化后的酶消解實驗對農產品中PtNPs的提取可獲得較高的顆粒數濃度回收率以及尺寸穩定的納米顆粒。

表4 實際樣品中PtNPs測定及樣品回收率

3 結論

開發可靠的高靈敏度定量分析農產品中金屬納米顆粒測定方法用于食品納米環境風險評估是至關重要的。本研究采用酶消解技術將農產品中PtNPs釋放出，結合SP-ICP-MS表征技術，準確測定農產品中PtNPs粒度分布和納米顆粒濃度。農產品中PtNPs粒度檢出限25 nm，顆粒濃度檢出限為5×105particles/L。采用酶消解-SP-ICP-MS技術研究了實際農產品中PtNPs，PtNPs顆粒濃度回收率在(81±3)%～(91±4)%，加標后平均粒徑(41±3) ～(47±2) nm，與50 nm PtNPs標準溶液粒徑接近。這說明建立的酶消解-SP-ICP-MS法能夠有效地定量分析農產品中PtNPs，可為后續農產品中PtNPs風險評估提供可靠的分析技術。