離子選擇電極陣列測定土壤中硝態氮

蘇 睿 苑 鋒 吳俊鋒 位文濤 VIJAYA Raghavan 胡建東，3*

(1.河南農業大學機電工程學院，河南省農業激光技術國際聯合實驗室，鄭州 450002；2.McGill大學生物資源工程系，加拿大 蒙特利爾 H9X 3V9；3.小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002)

硝態氮是土壤中重要的無機氮肥，可直接被作物吸收利用，土壤中硝態氮的含量是作物當季氮肥施用量估算和生育期追肥診斷的主要依據，增施氮肥是農業增產的重要措施之一，其含量的檢測是田間養分管理的重要指標[1-3]。由于硝酸根離子的高水溶性、流動性和生物降解性使它極易受環境溫度和農田灌溉及降水的影響而發生變化[4-5]。農用肥料和動物糞便中存在大量硝態氮，隨著農田灌溉及降水等原因，過剩的硝態氮會經過淋溶和地表徑流流入河湖和地下水導致水體富營養化[6-8]。同時，高濃度的營養物質已被確定為結直腸癌和非霍奇金淋巴瘤的潛在原因[9]。因此，土壤硝態氮的實時測定是精準施肥、作物養分管理和污染監控的重要環節[10-11]。

為實現土壤硝態氮原位實時測定，已嘗試了電化學法、光譜法，目前實驗室普遍使用光譜方法，與光譜方法相比電化學傳感器測量方法具有快速、靈敏、測量范圍廣、成本低等優點[12-14]。ADAMCHUK等人開發了利用離子選擇電極(ISE)直接土壤測試系統(DSM)，用于土壤養分分析和空間變異特征監測，與實驗室檢測相比硝酸根檢測結果相關系數(R2)僅在0.41～0.51[15]。KIM等[16]使用NPK三種離子選擇電極與一個參比電極組成傳感器陣列測定土壤提取物中的硝態氮濃度與常規實驗室測定方法相關系數(R2)為0.89。研究人員開發了一種基于離子選擇電極測定土壤養分測繪系統，該系統通常安裝在重型農用車上，用于繪制穿越農場地形時的土壤狀況[17]。TULLY等[18]使用ISE測量的土壤溶液硝態氮濃度與比色法進行了比較相關系數(R2)為0.96。

為了實現基層科學施肥、促進農業可持續發展、保證農民便捷操作，本論文結合電化學與流動分析法設計了一個全自動、低成本、便捷、易操作的實時土壤硝態氮測定系統。優選了全固態硝酸根離子選擇電極，且與溫度電極和pH電極融合組成電極陣列，并通過微處理控制蠕動泵完成土壤硝態氮待測溶液的連續流動測量及測試結果的傳輸。采用微處理器對電化學傳感器信號采集、處理、存儲、傳輸和控制蠕動泵流動傳輸樣品并與上位機相互傳輸。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

硝酸根全固態離子選擇電極(ISE)、pH電極、溫度傳感器(EAInstruments Limited公司)，紫外可見分光光度計(南京菲勒儀器有限公司)。

硝酸鈉和氯化鉀購自國藥化學試劑(上海)有限公司，用于配制一系列硝酸鹽標準溶液和土壤浸提液。所有試劑均為分析純(AR)等級，溶液均使用去離子水配制。

1.2 實際樣品的處理

采集許昌市(113°47′08″E，34°09′35″N)和潛江市(112°39′07″E，30°18′23″N)麥田土壤。采用五點取樣法采集土壤樣品，取樣位置為0～20 cm表層土。

1.3 電化學土壤硝態氮測試原理

固態離子選擇電極具有體積小、響應快等特點，便于在田間實時測定土壤硝態氮。離子選擇電極是一種利用膜電位測定溶液中離子活度或濃度的電化學傳感器，當將電極浸入待測溶液時，溶液中的游離待測離子將會擴散于電極膜外側直至內外濃度達到平衡，這樣在膜內側就形成一個電層，稱為膜界電位差，它與外部溶液中的待測離子數量成比例。離子濃度(活度)與電極電位之間的關系用Nernst方程表示

(1)

式中，E為電極檢測電勢，mV；E0為電極標準電勢，mV；R為氣體常數，取8.314 J/(mol·K)；T為絕對溫度，K；F為法拉第常數，取96487 C/mol；z為待測離子所帶電荷數；α為待測離子活度。

1.4 土壤硝態氮實時測定系統設計方案

圖1 離子選擇電極陣列硝態氮快速測定系統組成 (a)放大電路和阻抗匹配電路；(b)電路設計流程圖； (c)土壤硝態氮實時測定系統：①組合電極陣列；②過濾器；③攪拌器；④土壤含水率傳感器；⑤步進電機； ⑥蠕動泵；⑦樣品池；⑧電子秤；⑨液晶觸摸屏和控制電路Figure 1 The system components of nitrate nitrogen measurement using ions selective electrode.(a) Amplification circuit and impedance matching circuit；(b) Diagram of the Electric Control Circuit Design；(c) Real-time determination system of soil nitrate nitrogen：①Combination electrode array；②Filter；③Stirrer；④Soil water content sensor； ⑤Stepper motor；⑥Peristaltic pump；⑦Sample cell；⑧Electronic scale；⑨LCD touch screen and control circuit

2 結果與分析

2.1 離子選擇電極系統的響應時間

當將電極浸入有硝酸根離子的待測溶液時，溶液中的游離硝酸根離子將會擴散于電極固態PVC膜外側，直至內外濃度達到平衡。這樣在膜內側就形成一個電層，稱為膜界電位差，它與外部溶液中的硝酸根離子濃度的對數成比例。

根據國際純化學與應用化學聯合會(IUPAC)的建議，達到平衡電位值將電勢變化達到總變化量的95%所需要的時間定義為響應時間。隨著硝酸根離子濃度的提高，實時測定系統對標準樣品的響應時間越快，如圖2所示，平衡電勢可在15 s內完成響應。

圖2 土壤硝態氮實時測定系統對標準樣品響應時間Figure 2 Response time of soil nitrate nitrogen real-time measurement system to standard sample.

2.2 離子選擇電極系統的靈敏度

根據國際純化學與應用化學聯合會(IUPAC)規定，由低至高濃度檢測一系列的硝態氮標準溶液，測定不同濃度(15 000、1 000、750、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 mg/kg)下硝態氮的響應電壓。測定完成根據數據繪出硝酸根離子濃度對數與離子選擇電極(ISE)響應電壓的線性關系圖。由圖3a可知，離子斜率為-51.63 mV/decade處于理論值(54±5) mV/decade合理范圍內。線性范圍可確定為10-5～10-2.2mol/L，如圖3b所示。空白試劑重復11次測得的檢出限(LOD=3S/b。其中S為11次測定值的標準偏差，b為接近LOD標準曲線的斜率)為10-5.23mol/L。

2.3 離子選擇電極系統的準確度和精密度

在自動測定條件下，篩選21個土壤樣品進行檢測，采用五點取樣法采集土壤樣品。首先添加標準樣品，計算加標回收率來評價系統的準確性，如表1 所示，加標回收率在90.0%～110%。每個樣品測試7次，計算得各驗證樣本的相對標準差(RSD)為0.78%～4.5%。結果表明，離子選擇電極系統具有的準確度和精密度，可以滿足土壤硝態氮的現場檢測需求。

圖3 土壤硝態氮實時測定系統 (a)標準曲線；(b)檢測范圍Figure 3 Soil nitrate nitrogen real-time measurement system. (a)Standard curve；(b)Detection range

2.4 與紫外可見分光光度法測定結果比對

選擇21個土壤樣品分別使用離子選擇電極系統和紫外分光光度法測定，測定結果如圖4a所示，兩者R2可達到0.995 2，兩個檢測系統測定的結果具有較好的線性關系。將測得數據通過GraphPad Prism軟件進行Bland-Altman一致性分析，Bland-Altman法作為新的圖形分析法，從集中趨勢、離散趨勢、同步變化程度多角度評價新舊檢驗方法或檢驗系統的一致性，彌補了t檢驗、相關分析和回歸分析的不足。分析兩種檢測系統的相對偏移，兩種檢測系統的測定結果一致性較好，測定值均在95%一致性區間內，見圖4b。綜上所述，相較于復雜的光學檢測儀器，該儀器成本低，操作便捷，適用于田間土壤硝態氮實時檢測。

表1 土壤硝態氮實時測定系統加標回收率 和相對標準偏差

圖4 (a)土壤硝態氮實時測定系統與紫外分光光度計 測定結果的相關性；(b)Bland-Altman圖Figure 4 (a)Correlation between the results from ISE system and UV-Vis spectrophotometry；(b)Bland-Altman diagram.

3 結論

采用全固態硝酸根離子選擇電極，且與溫度電極和pH電極融合組成電極陣列，設計了一個土壤硝態氮實時測定系統，通過微處理控制蠕動泵完成土壤硝態氮待測溶液的連續流動測量及測試結果的傳輸。相對于標準樣品，系統響應時間≤15 s，斜率為51.63 mV/decade。線性范圍在10-5～10-2.2mol/L內，最低檢測限為10-5.23mol/L。相對標準差在0.78%～4.5%，加標回收率均在90.0%～110%。使用土壤硝態氮實時測定系統對許昌市和潛江市土壤樣品進行測定，與國家標準測定紫外分光光度法測定的結果相關性R2可達到0.995 2，通過Bland-Altman一致性分析，測值均在95%一致性區間內，兩種方法測值差異無統計學意義，具有較好的一致性。該系統在響應時間、靈敏度、準確度和精確度多方面能滿足現場檢測要求。