動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者介入治療后miR-27a 表達水平及意義

陳飛虎，陳建龍，林海峰

動脈瘤性蛛網膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH）是一種由顱內動脈瘤破裂導致的腦出血性疾病，有發病率高、致殘率高和致死率高等特點［1-2］。目前，針對aSAH 的治療雖取得一定進展，但預后仍不容樂觀，其長期死亡率仍高達10%～24%［3-4］。探究預示aSAH 預后的指標有著重要意義，可有效輔助臨床治療方案和康復管理方案的制定。有研究報道，上調微小核糖核酸-27a（microRNA-27a，miR-27a）表達可抑制神經元凋亡，增強神經元活性，從而改善aSAH 誘發的大鼠腦部損傷和認知功能障礙［5］。基于此，推測miR-27a與aSAH 預后有關，是其預后評估的潛在生物標志物。目前，鮮有研究分析miR-27a 與aSAH 預后的關系，本研究選取接受介入治療的aSAH 患者作為研究對象，分析介入治療前后miR-27a 表達水平變化及其與aSAH 預后的關系，以期為aSAH預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2021 年1 月在文昌市人民醫院接受介入治療的171 例aSAH 患者作為研究對象。參照《中國蛛網膜下腔出血診治指南2019》中相關標準診斷aSAH［6］。納入標準：（1）經血管造影確診為aSAH，且患者首次發病；（2）發病12 h 內接受彈簧圈動脈瘤栓塞術治療。排除標準：（1）外傷誘發的腦出血；（2）既往有腦卒中史、神經退行性疾病史等；（3）嚴重的心肝腎等功能異常或惡性腫瘤；（4）血小板計數＜100×109/L 或國際標準化比值＞1.4；（5）生命體征不穩定。受試對象中男性67 例，女性104 例；年齡（47.37±4.96）歲，范圍40～64 歲。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，所有aSAH 患者或家屬均知情同意，簽署了知情同意書，本研究經文昌市人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-27a 表達水平檢測 分別于介入治療前和介入治療后24 h 抽取aSAH 患者的肘部靜脈血10 ml，離心后提取血清，將其凍存于-80℃冰箱中保存，待驗。用實時熒光定量PCR 法［7］檢測aSAH 患者血清miR-27a 表達水平。實驗步驟：（1）取凍存的血清，解凍后用RNA 提取試劑盒（日本TAKARA 公司）提取血清中總RNA；（2）用752 型紫外分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司）檢測RNA 純度，本實驗中RNA 的吸光度值（OD260/280）比均在1.9～2.0；（3）取2 μg 的RNA，用逆轉錄試劑盒（日本TAKARA 公司）將其轉錄為cDNA；（4）用CFX96 型實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）擴增cDNA，反應條件為95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40 個循環。miR-27a 上游序列：5′-CGCGTTCACAGTGGCTAAGT-3′，下游序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；內參U6 上游序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。ΔCt=CtmiR-27a-CtU6，用2-ΔΔCt計算miR-27a 的相對表達水平。

1.2.2 預后隨訪及評估 本研究采用門診和電話等方式隨訪，了解aSAH 患者精神狀態、日常生活狀況等，本研究共隨訪了211 例aSAH 患者，其中40 例隨訪失聯（未納入研究進行分析），失訪率為18.96%，隨訪截止時間為2021 年4 月23 日。采用改良Rankin 量表（modified Rankin scale，mRS）評分評價aSAH 患者治療90 d 預后，mRS≤2 分為預后良好，mRS＞2 分為預后不良。mRS 評分賦分標準：（1）癥狀輕微，無明顯殘疾，可獨自完成日常活動賦1 分；（2）輕度殘疾，能獨自料理日常生活，但不能完全從事發病前的活動賦2 分；（3）中度殘疾，可獨自行走，但其他復雜日常活動需他人幫助賦3 分；（4）重度殘疾，不能獨自行走，且其他日常活動需他人照顧賦4 分；（5）嚴重殘疾，患者持續臥床，大小便失禁，需持續床旁護理賦5 分；（6）死亡賦6 分［8］。本研究中預后良好組124 例，預后不良組47 例。

1.3 統計學處理

用SPSS 23.0 軟件做統計分析。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，2 組間比較用獨立樣本t檢驗；預后不良組和預后良好組介入治療前后的miR-27a 表達水平比較用重復測量方差分析。計數資料用百分比（%）表示，2 組間比較用χ2檢驗。用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價miR-27a 判斷aSAH 預后的價值。用Logistic 回歸分析aSAH 預后的風險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預后良好組和預后不良組基線資料比較

預后良好組和預后不良組的性別構成、體質量指數（body mass index，BMI）、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史和動脈瘤位置差異均無統計學意義（P＞0.05）。預后不良組的年齡、Hunt-Hess Ⅲ級占比、Fisher Ⅲ級占比、腦血管痙攣占比、格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma scale，GCS）評分和C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）均高于預后良好組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 預后良好組和預后不良組的動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者基線資料比較

2.2 預后良好組和預后不良組治療前后血清miR-27a 表達水平比較

預后良好組和預后不良組的血清miR-27a 相對表達水平差異有統計學意義（F=46.692，P＜0.01），預后良好組治療前后的血清miR-27a 相對表達水平均高于預后不良組（P＜0.05）；治療前后的血清miR-27a 相對表達水平差異有統計學意義（F=140.703，P＜0.01），治療后的血清miR-27a 相對表達水平均高于治療前（P＜0.05）；預后和時間有交互效應（F=10.920，P=0.001），預后良好組治療前后血清miR-27a相對表達水平變化值高于預后不良組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 預后良好組和預后不良組的動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者治療前后血清miR-27a 表達水平比較（± s）

表2 預后良好組和預后不良組的動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者治療前后血清miR-27a 表達水平比較（± s）

注：與治療前比較aP＜0.05，與預后良好組比較bP＜0.05

分組預后良好組預后不良組治療后1.27±0.13a 1.11±0.12ab例數124 47治療前1.05±0.13 0.98±0.12b

2.3 miR-27a 判斷aSAH 預后的價值

治療前血清miR-27a 判斷aSAH 患者90 d 預后的ROC曲線下面積、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.656（95%CI：0.563～0.749）、1.05、76.60% 和52.42%；治療后血清miR-27a 判斷aSAH 患者90 d 預后的ROC 曲線下面積、最佳截斷點、靈敏度和特異度分別為0.814（95%CI：0.734～0.895）、1.14、72.34%和85.48%。治療后血清miR-27a 判斷aSAH 患者90 d 預后的ROC 曲線下面積高于治療前血清miR-27a（Z=2.618，P=0.009）。見圖1。

圖1 miR-27a 判斷aSAH 患者90 d 預后的ROC 曲線

2.4 aSAH 預后的風險因素分析

將aSAH 患者90 d 預后作為因變量，將年齡、GCS 評分、CRP、Hunt-Hess 分級、Fisher 分級、腦血管痙攣和治療后miR-27a 作為自變量（納入標準為P＜0.1，變量賦值見表3），納入Logistic 回歸分析，結果顯示GCS 評分高、CRP 水平高、Hunt-Hess Ⅲ級和腦血管痙攣均是aSAH 患者90 d 預后的獨立危險因素（P＜0.05），治療后miR-27a 是aSAH 患者90 d預后的獨立保護因素（P＜0.05）。見表4。

表3 變量賦值

表4 動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者預后的風險因素分析結果

3 討論

早期發現aSAH 預后不良的高危患者，給予及時有效的干預，可一定程度上降低aSAH 致殘率，改善患者的生活質量［9］。探究預示aSAH 預后不良的生物標志物有著重要意義。

炎癥反應是出血性腦損傷的重要機制，且其被認為與繼發性腦損傷有關，其相關標志物對aSAH 預后有一定價值［10-12］。miR-27a 已被報道與多數炎癥性疾病有關，如其可靶向磷脂酰肌醇3 激酶/絲蘇氨酸激酶/雷帕霉素靶蛋白通路促進白細胞介素-1β 誘導的關節軟骨細胞自噬和凋亡［13］，此外，其還可抑制toll 樣受體4 誘導的腎臟缺血再灌注損傷［14］。目前，多數研究［5，15］報道miR-27a 與腦出血后損傷及神經功能恢復等有關。本研究中預后良好組治療前后的血清miR-27a 相對表達水平均高于預后不良組，2 組治療后的血清miR-27a 相對表達水平均高于治療前，預后良好組治療前后血清miR-27a 相對表達水平變化值高于預后不良組，上述結果提示血清miR-27a 與aSAH 患者90 d 預后有關，或可用于aSAH 預后評估。

本研究構建了治療前后的miR-27a 判斷aSAH 患者90 d 預后的ROC 曲線，結果顯示治療后血清miR-27a 判斷aSAH 患者90 d 預后的ROC 曲線下面積為0.814，高于治療前血清miR-27a，該結果提示治療后血清miR-27a 對aSAH患者90 d 預后有一定判斷價值，可輔助臨床醫師決策。為避免混雜因素影響分析結果，本研究調整了年齡、GCS 評分、CRP、Hunt-Hess 分級、Fisher 分級和腦血管痙攣等因素，結果顯示治療后miR-27a 是aSAH 患者90 d 預后的獨立保護因素，推測其原因有二，一是miR-27a 過表達可靶向微管相關蛋白tau 抑制神經元凋亡，增強神經元活性［5，15］；二是miR-27a 過表達可抑制炎癥性損傷［13-14］，從而保護神經元。miR-27a 可通過上述機制改善aSAH 誘發的腦部損傷和認知功能障礙，其血清表達水平可反映腦部損傷和認知功能障礙等情況，進而反映預后。此外，本研究結果還顯示GCS 評分高、CRP 水平高、Hunt-HessⅢ級和腦血管痙攣均是aSAH 患者90 d 預后的獨立危險因素，與既往研究［16-18］結果一致。

綜上所述，aSAH 患者介入治療后miR-27a 表達水平低與其90 d 預后不良有關，其可輔助臨床決策。本研究尚存在一定不足，一是本研究選取對象為接受血管內介入治療的aSAH 患者，對于miR-27a 評價接受開顱夾閉術的aSAH 患者預后的價值還未可知；二是本研究僅分析miR-27a 評價接受血管內介入治療的aSAH 患者90 d 預后的價值，關于其對患者遠期預后的判斷價值還需進一步研究；三是本研究樣本量有限，分析結果可能存在一定偶然性，后續還需開展大樣本、多中心研究充實本研究內容。