顱內外動脈狹窄患者血清中6個miRNAs的差異表達及意義*

袁平 李其玲 周陽 李經綸 周翔宇

(1.西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川 瀘州 646000；2.隆昌市人民醫院神經內科，四川 隆昌 642150；3.西南醫科大學附屬醫院甲狀腺血管外科，四川 瀘州 646000；4.德陽市人民醫院血管外科，四川 德陽 618000)

腦卒中是全球主要的致殘及死亡病因之一，缺血性卒中更是占到所有急性卒中的87%，顱內外動脈狹窄是其主要誘發因素[1]。miRNAs(小型非編碼RNA)逐漸成為中風發病機制中的關鍵因素，并參與關鍵代謝的調控、炎癥和血管生成[2]。研究顯示，miRNAs可以介導動脈粥樣硬化的發生和發展，從而致使顱內外動脈狹窄，其主要是通過調控脂質代謝，影響血管平滑肌細胞的增殖、遷徙以及細胞外基質的合成與降解等表型功能實現的[3]。但有關miRNAs在顱內外動脈狹窄患者中的作用仍有待進一步證實。因此，本研究旨在探討顱內外動脈狹窄患者血清中一系列miRNAs的表達水平并分析其臨床相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年9月～2018年12月西南醫科大學附屬醫院神經內科收治的99例急性缺血性腦卒中患者。其中，男性74例，女性25例，平均(60.19±9.96)歲。依據腦血管造影(Angiography,DSA)結果分為對照組(顱內外動脈無狹窄，NOCS組，n=33)和狹窄組(n=66)。狹窄組按狹窄部位分為ICAS組(單純顱內動脈狹窄，n=24)、ECAS組(單純顱外動脈狹窄，n=18)、COMS組(顱內外動脈均有狹窄，n=24)；按狹窄程度分為輕度、中度、重度狹窄組。納入標準：①診斷明確的缺血性腦卒中患者按照《2014年中國急性缺血性腦卒中診療指南》臨床診斷標準。②診斷明確的顱內外動脈狹窄患者按照《2015中國缺血性腦血管病血管介入診療指南》臨床診斷標準。③患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①血液病、動靜脈畸形、動脈炎、動脈剝離、惡性腫瘤等非動脈粥樣硬化因素引起的缺血性腦卒中。②由心源性栓塞或其他明確栓子引起腦栓塞的患者。③嚴重心、肝、腎功能不全患者。④任何原因導致不能或不愿配合檢查的患者。本研究通過西南醫科大學附屬醫院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 采集腦卒中患者靜脈血約3 mL，放入含EDTA的試劑管中，并迅速以3000 r/min離心15 min。之后，無酶EP管中收集上清200 μL，轉移至-80℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR引物 從四川愛奇生物科技有限公司購買人miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-125a-5p、miR-186-5p、miR-208b-3p等PCR引物，為確保序列的準確性，應用NCBI對每條相關引物進行特異性驗證、分析。

1.2.3 RNA的提取和定量 RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。測定所提取的RNA濃度和檢測其完整性(微量分光光度計法)后，根據實時熒光定量RT-qPCR儀的操作說明，實時定量聚合酶鏈反應(PCR)法檢測miRNA的表達情況，采用2-△△Ct法分析數據表達量情況。

1.3 觀察指標 ①各組患者的一般臨床資料特征比較，包括男性、吸煙、高血壓、糖尿病比例，中性粒細胞淋巴細胞比值(NLR)、尿酸(UA)、胱抑素C(Cys-c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A1(Apo A1)、載脂蛋白B(Apo B)、纖維蛋白原(Fib)等各指標。②對照組與狹窄組血清中miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p的表達水平比較。③對照組及不同狹窄程度組間miRNA的表達水平比較。④不同部位狹窄組間miRNAs表達水平比較。

2 結果

2.1 各組相關臨床指標的比較 本研究將納入的腦卒中患者根據發生狹窄的部位的不同分為四組：NOCS組、ICAS組、ECAS組、COMS組。與NOCS組相比，ICAS組、ECAS組及COMS組中男性、吸煙、高血壓比例、UA、Cys-c、TC、LDL-C、Apo A1、Apo B等指標均具有統計學差異(P<0.05)。而COMS組年齡明顯高于NOCS組(P<0.05)。各組糖尿病病例、HDL-C、NLR、TG、Fib等指標無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組相關臨床指標的比較

2.2 顱內外動脈狹窄組和對照組血清中各miRNA的表達比較 RT-qPCR測定各組血清的miRNA表達水平結果顯示，與對照組相比，狹窄組患者血清中miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p的表達水平均明顯升高(P<0.01)，而miR-125a-5p在狹窄組患者血清中的表達水平明顯降低(P<0.01)，兩組患者血清miR-208b-3p表達水平無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 狹窄組和對照組血清miRNAs的相對表達水平比較

2.3 對照組及不同狹窄程度組間miRNA表達水平的比較 結合DSA，根據動脈狹窄程度將顱內外動脈狹窄患者又分為輕度狹窄組(n=13)、中度狹窄組(n=18)和重度狹窄組(n=35)。與對照組比較，各不同程度狹窄組miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p和miR-186-5p的表達情況均明顯升高(P<0.001)，miR-125a-5p的表達水平均明顯降低(P<0.001)。重度狹窄組miR-17-5p的表達水平明顯高于輕度狹窄組，miR-27b-3p表達水平高于輕、中度狹窄組，miR-125a-5p的表達水平卻明顯低于輕度狹窄組(均P<0.001)。輕、中度狹窄組miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-125a-5p和miR-186-5p表達水平比較無統計學差異(P>0.05)；在3組狹窄組血清中，miR-92a-3p的表達水平比較差異具有統計學意義(均P<0.001)，miR-186-5p的表達水平均無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 對照組及不同狹窄程度組血清miRNAs的相對表達水平比較

2.4 不同部位狹窄組間miRNAs 表達水平的比較 根據動脈狹窄部位的不同分為ICAS組(包括輕度狹窄7例，中度狹窄8例，重度狹窄9例)、ECAS組(包括輕度狹窄3例，中度狹窄4例，重度狹窄11例)和COMS組(包括輕度狹窄3例，中度狹窄6例，重度狹窄15例)。在COMS組中，盡管miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p和miR-186-5p的表達水平均高于ICAS組和ECAS組，miR-125a-5p表達低于ICAS組和ECAS組，然而統計學分析顯示差異并無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 在不同部位動脈狹窄組間miRNAs的表達水平比較

3 討論

腦卒中是一組由腦血管缺血或破裂出血而導致的疾病，其中缺血性腦卒中最為常見，發病率約占80%，其主要病理過程為動脈粥樣硬化性(Atherosiclerosis, AS)狹窄，往往顱內外動脈都受累[1]。本研究中，首先分析了顱內外動脈狹窄患者的相關臨床指標，發現載脂蛋白A1、載脂蛋白B等有明顯差異，說明該疾病與動脈硬化的高危因素密切相關，這與文獻報道結果相似[4]。盡管篩查顱內外動脈狹窄的方法如頸動脈超聲、腦血管造影、TCD及CT/MRI血管成像等廣泛應用，并非所有人群都能從上述篩查手段中確診并獲益[5]。因此，進一步尋找與顱內外動脈狹窄相關的生物標記物，對于頸內外動脈狹窄的臨床診斷和預測仍具有一定的意義。

miRNA是一類通過作用于多個靶基因調控不同的生物學過程的短鏈微小RNA[2]。miR其在疾病的早期病理過程中便可發生顯著變化[6]，并且在血液中具有可靠的穩定性。因此，檢測血液中的miRNA的表達水平并將其作為生物學標記物具有一定的臨床意義及可行性。本研究通過查閱文獻，選取了可能具有差異表達的6個miRNAs，檢測了其在顱內外動脈狹窄患者血清中的表達量。結果表明，在顱內外動脈狹窄患者血清中， miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p表達明顯升高，miR-125a-5p表達水平明顯降低，說明上述5個miRNAs參與顱內外動脈狹窄的發病過程。根據狹窄程度不同分組，輕度、中度、重度動脈狹窄組患者血清中，都存在不同miRNA表達差異，說明血清miRNAs的差異可以在一定程度上部分反映頸動脈狹窄程度，從而有利于臨床評估。就狹窄的不同部位而言，顱內外動脈均有狹窄組患者血清中，miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p水平顯著高于單純性顱內或顱外組。顱內外動脈同時發生狹窄的病情嚴重程度可能相較于單純性顱內或顱外動脈狹窄更重，這可能是miRNAs差異表達的原因。但也不能排除其差異表達與顱內外動脈狹窄發生部位的不同有關。因此，可以嘗試將其作為預測顱內外動脈同時發生狹窄的生物學標記物。

作為miR-17-19族的成員， miR-17-5p已被證實在惡性腫瘤的增殖和遷徙[7]、炎癥反應的發生及AS的形成[8]等病理過程中都有重要的作用。其影響AS發生、發展進程可能與miR-17-5p誘導血管平滑肌細胞異常增殖相關[9]。多項研究顯示miR-17-5p可以作為預測冠狀動脈血管狹窄[5]及其狹窄嚴重程度[10]的重要標志物，但未涉及到頸動脈及顱內動脈狹窄的情況。有研究認為miR-17-5p的升高與腦卒中患者的預后相關，但并未評估血清中miR-17-5p水平與顱內外動脈狹窄程度相關性[11]。本研究發現，在顱內外動脈狹窄患者血清中miR-17-5p表達明顯升高，并與狹窄程度顯著相關，提示miR-17-5p可能是預測顱內外動脈狹窄發生和嚴重程度的生物標志物。

血清中miR-27b-3p水平與胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)及IGF-1水平呈負相關，而缺血性腦卒中的發生率又與IGF-1水平呈正相關，提示miR-27b-3p可能參與缺血性腦卒中的病理生理過程[14]。同時，在無癥狀頸動脈狹窄患者血清中miR-27b-3p升高，結合本研究結果，miR-27b-3p的變化與顱內外動脈狹窄的程度呈正相關，進一步說明miR-27b-3p不僅有預測頸動脈狹窄的作用，在一定程度上有利于判斷顱內外動脈狹窄的情況。

多項對冠狀動脈硬化的研究顯示，miR-92a-3p的升高可能與動脈痙攣直接或間接導致AS的形成相關[13-14]，且與粥樣斑塊形成面積呈正相關[15]。本研究發現在顱內外動脈狹窄患者血清中miR-92a-3p的表達顯著升高，提示其可能是缺血性腦卒中發生和發展中一個重要的環節。

最新研究認為血清miR-186-5p在無癥狀頸動脈狹窄早期診斷中的潛在作用，并明確其過表達與無癥狀頸動脈狹窄患者腦卒中發生率密切相關，其研究結果表明miR-186-5p可以作為無癥狀頸動脈狹窄患者的潛在診斷生物標志物，并能夠作為未來腦卒中事件的預測因子[16]。本研究也證實，在有癥狀顱內外動脈狹窄者中，miR-186-5p不僅能作為腦卒中事件的預測因子，也可能預測顱內外動脈不同狹窄程度。

miR-125a-5p可以作為風濕性關節炎患者冠狀動脈粥樣硬化的預測標記物[17]，其參與到AS過程可能與其能誘導血管內皮細胞發生異常凋亡有關[18]。然而，對于miR-125a-5p對顱內外動脈狹窄及狹窄程度的預測作用，國內外研究均鮮有報道。而我們的研究結果支持miR-125a-5p可能作為顱內外動脈狹窄及狹窄程度的潛在預測因子。

既往研究顯示，心肌缺血再灌注損傷病理過程的加重與miR-208b-3p的高表達相關。同時，在有癥狀的頸內動脈狹窄和無癥狀頸內動脈狹窄中，miR-208b-3p的表達水平存在顯著差異[19]。然而本研究中，miR-208b-3p的表達無統計學差異。可能的原因，一方面可能與納入的病例數相對較少相關，另一方面雖然miRNAs在循環中具有穩定表達，但其在組織、血清、血漿中的表達可能存在差異[20]。因此，未來在血漿、組織中的大樣本數據驗證仍然是有必要的。

4 結論

本研究通過檢測6個miRNAs在顱內外動脈狹窄組患者血清中的表達水平并分析其相關性，發現miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p、miR-125a-5p的表達改變與缺血性腦卒中患者顱內外動脈狹窄聯系緊密，且表達水平從某種程度反映顱內外動脈狹窄程度，可能對未來預測顱內外動脈狹窄程度提供新的生物標志物。