缺氧條件下Netrin-1通過激活PI3K/AKT通路誘導宮頸癌細胞上皮-間質轉化*

張曉涵 遲淑娜 徐征鵬

(濱州醫學院臨床學院婦科腫瘤，山東 煙臺 264000)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在發展中國家發病率和致死率僅次于乳腺癌，嚴重危害著女性健康。隨著宮頸癌危險因素暴露的增加，宮頸癌發病率逐年增高且呈年輕化趨勢[1-2]。宮頸癌的發生和發展過程復雜，涉及多種病理過程，侵襲和轉移是宮頸癌患者死亡的主要原因[3-4]。宮頸癌患者的預后與腫瘤是否浸潤、轉移密切相關，其中上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用尤為重要[5-6]。EMT是一個涉及上皮細胞極化的生物學過程，可使細胞呈間充質細胞表型，同時賦予細胞遷移、侵襲、抗凋亡等能力以及ECM(細胞外基質)成分的產生[7-8]。研究發現，低氧微環境會改變腫瘤細胞的代謝方式，誘導細胞代謝發生適應性變化，并調節腫瘤細胞中信號傳導和代謝通路，此外，低氧微環境還可通過上調EMT相關的轉錄因子激活與EMT信號通路，從而誘發EMT[9]。Netrin-1是最早在神經系統中發現的可溶性神經軸突導向因子，在細胞生長過程中促進細胞黏附和遷移，具有調控血管生成和類似血管表皮生長因子的作用[10]。Netrin-1還被視為致癌基因, 促進腫瘤的生長，在許多腫瘤組織中高表達。研究發現，Netrin-1能促進結直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤細胞侵襲和轉移[11-12]。但目前Netrin-1是否在低氧誘導的宮頸癌細胞EMT中發揮作用文獻鮮少。基于此，本研究試圖探究Netrin-1在低氧誘導的宮頸癌細胞EMT中的作用及其機制，為宮頸癌治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人正常上皮細胞HaCaT(CL-0090)及人宮頸癌細胞系CasKi(CL-0048)購自Procell公司，人宮頸癌細胞系SiHa(TCHu113)、Hela(TCHu187)購自中國科學院細胞庫。二氧化鈷購自廣州金華大化學試劑公司，胎牛血清購自Hyclone公司，DMEM培養基和RPMI-1640培養基購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，胰酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司，總RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，Primescript RT逆轉錄試劑盒購自北京智杰遠科技有限公司，qPCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。Netrin-1敲低載體Si-Netrin-1 (siRNA-Netrin-1)、Si-NC (siRNA-negative control) 等由吉瑪基因公司負責構建，Lipofectamine 2000購自日本TaKaRa公司，一抗GAPDH(5174)、E-cadherin(14472)、Vimentin(5741)、AKT(4691)、p-AKT(4060)均購自CST公司，Netrin-1(ab126729) 購自Abcam公司。羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗均購自武漢博士德公司，ECL試劑盒購自美國Millipore公司。

1.2 細胞培養 人宮頸癌細胞系SiHa、Hela，人正常上皮細胞HaCaT用DMEM(含10%FBS)培養基，人宮頸癌細胞系CasKi用RPMI-1640(含10%FBS)培養基，置于5% CO2細胞培養箱37℃過夜培養，待細胞生長至對數生長期時備用。細胞分為常氧組和低氧組，低氧組應用二氧化鈷處理，終濃度為150 μmol/L，常氧組應用正常培養基培養。

1.3 細胞轉染 人宮頸癌細胞系SiHa細胞生長至對數生長期時用胰酶消化、計數，然后接種于6孔板，培養24 h以備轉染。嚴格按照Lipofectamine 2000 試劑盒說明書分別轉染Si-NC、Si-Netrin-1至SiHa細胞，轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞的轉染效果，并通過qPCR和蛋白質印記法檢測各組細胞的轉染效率。

1.4 qPCR檢測Netrin-1的表達 采用TRIzol一步法分別提取待測細胞中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度，隨后采用Primescript RT試劑逆轉錄成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，取1 μg逆轉錄產物為模板行qPCR，反應體系(20 μL)為：2 μL逆轉錄產物、10 μL SYBR Green Mix、0.4 μL ROX Reference Dye、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、6 μL ddH2O。預變性95℃、5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸 1 min，循環45次后進行終延伸完成PCR。采用 2-△△Ct法計算目的基因Netrin-1表達量。以GAPDH為內參，引物序列見表1，實驗獨立重復3次。

表1 qPCR引物序列

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Netrin-1、E-cadherin、Vimentin、AKT等蛋白表達水平 胰酶消化人宮頸癌細胞，離心5 min，PBS溶液洗滌，棄上清，重復3次。提取各組細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每組取50 μg進行SDS-PAGE分離蛋白條帶，用電轉移法將目的蛋白轉移至 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜；次日，TBST洗滌3次，加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h；TBST洗滌3次后加入 ECL 化學發光液進行顯影，然后在凝膠成像儀上觀察拍照。

1.6 細胞劃痕愈合實驗檢測宮頸癌細胞遷移能力 將對數生長期的各組細胞，按5×105個/孔的密度接種于6孔板中，培養24 h后觀察培養皿底部細胞融合率達90%，用200 μL槍頭垂直于細胞平面劃“十”字，PBS清洗細胞2次，更換培養液，24 h后在光學顯微鏡下觀察相同位置劃痕愈合情況并拍照。

1.7 Transwell小室侵襲實驗檢測宮頸癌細胞侵襲能力 取24孔板，置入Transwell小室，用基礎培養液稀釋Matrigel(體積稀釋比例為1∶8)，每個小室的上室內加入50 μL稀釋后的Matrigel，置于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養過夜；次日取出小室，吸出上室和下室內剩余的培養液；將對數生長期的各組細胞消化離心，用PBS洗滌細胞2次，用無血清培養液重懸細胞，在每個小室上室內加入3×104個細胞/200 μL的細胞懸液，下室內加入500 μL含10% FBS的完全培養液，置于培養箱中培養24 h。取出小室，用棉簽將上室底部的細胞擦拭掉，用PBS洗滌小室底面3次，4%多聚甲醛溶液固定細胞，再次PBS洗滌小室底面3次，1%結晶紫染色30 min，光學顯微鏡(Nikon TS100，日本Nikon公司產品)下觀察并拍照。

1.8 統計學分析 使用SPSS 20.0軟件進行實驗數據分析，采用GraphPad 7.0軟件進行相關圖片繪制。所有實驗獨立重復3次，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Netrin-1在宮頸癌細胞系中呈高表達 qPCR結果顯示，相對于正常人上皮細胞HaCaT，Netrin-1基因在宮頸癌細胞系SiHa(P<0.001)、Caski(P<0.01)、Hela(P<0.01)中均高表達(圖1A)。Western Blot結果顯示，相對于正常人上皮細胞HaCaT，Netrin-1蛋白表達水平在宮頸癌細胞系SiHa、Caski、Hela中明顯升高(圖1B)，且在細胞系SiHa、Caski中表達水平較高，并選取SiHa、Caski細胞進行后續實驗。上述結果表明，Netrin-1在宮頸癌細胞中異常高表達，可能與宮頸癌的發生發展有著密切的聯系。

圖1 Netrin-1在宮頸癌細胞株中高表達

2.2 低氧條件下SiHa、Caski經歷上皮-間質轉化過程 Western Blot結果顯示，相對于常氧組，低氧組SiHa、Caski細胞中的上皮細胞標志蛋白E-cadherin顯著下調，而間充質細胞標志蛋白Vimentin顯著上調(圖2A)。Transwell侵襲實驗結果顯示，相對于常氧組，宮頸癌細胞系SiHa、Caski在低氧條件下顯示出更強的細胞侵襲能力(圖2B)。細胞劃痕愈合實驗結果顯示，SiHa、Caski細胞在低氧條件下擁有比常氧組更快的細胞損傷愈合能力(圖2C)。上述實驗結果表明，SiHa、Caski細胞在低氧條件下培養時上皮標志蛋白E-cadherin下調，間充質細胞標志蛋白Vimentin上調，細胞侵襲及轉移能力增強。

圖2 低氧條件下SiHa、Caski經歷上皮-間質轉化過程

2.3 低氧條件下誘導Netrin-1在SiHa、Caski細胞中表達升高 Western Blot結果顯示，相對常氧組，SiHa、Caski細胞在低氧條件培養24 h后Netrin-1蛋白表達水平顯著升高(圖3A)。qPCR檢測SiHa、Caski細胞中Netrin-1表達結果顯示，相對于常氧組，Netrin-1基因在在低氧組被顯著上調(圖3B)。上述結果表明，SiHa、Caski細胞在低氧條件培養24 h后，Netrin-1在基因及蛋白水平顯著上調(均P<0.01)。

圖3 低氧誘導條件下Netrin-1在SiHa、Caski細胞中表達升高

2.4 敲低Netrin-1抑制低氧條件誘導的SiHa細胞侵襲、遷移能力 Western Blot結果顯示，相對于Control組，Netrin-1在SiHa細胞中被成功敲低(圖4A)。并且發現在低氧條件下敲低Netrin-1可以顯著上調上皮細胞標志蛋白E-cadherin的表達，而間充質細胞標志蛋白Vimentin被顯著下調(P<0.05、P<0.001，圖4B)。Transwell侵襲實驗結果顯示，敲低Netrin-1基因，可以抑制低氧條件下SiHa細胞的侵襲能力(圖4C)。細胞劃痕愈合實驗結果顯示，相對于Control組，Netrin-1敲低組細胞損傷愈合能力顯著減弱(圖4D)。上述實驗結果表明，敲低Netrin-1可抑制低氧條件誘導的SiHa細胞侵襲、遷移能力。

圖4 敲低Netrin-1可抑制低氧條件誘導的SiHa細胞侵襲、遷移能力

2.5 敲低Netrin-1常氧組SiHa細胞的侵襲、遷移能力無顯著性變化 Western Blot結果顯示，敲低Netrin-1，常氧組SiHa細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達沒有顯著性變化(圖5A)。Transwell侵襲實驗結果顯示，常氧培養條件下，與Control組和Si-NC組相比，Si-Netrin-1組細胞的侵襲能力無顯著性改變(P>0.05，圖5B)。細胞劃痕愈合實驗結果顯示，Netrin-1基因的敲低，對SiHa細胞的遷移能力無顯著影響(圖5C)。上述結果表明，常氧培養條件下敲低Netrin-1，SiHa細胞的侵襲、遷移能力無顯著性變化(P>0.05)。

圖5 敲低Netrin-1正常氧氣組SiHa細胞的侵襲、遷移能力無顯著性變化

2.6 缺氧條件下Netrin-1通過激活PI3K/AKT通路誘導SiHa細胞上皮-間質轉化 Western Blot結果顯示，相對于常氧組，低氧條件下AKT蛋白表達在宮頸癌細胞系SiHa中沒有變化(P>0.05)，但是其磷酸化形式p-AKT顯著升高，當在低氧條件下敲低Netrin-1，p-AKT水平卻被顯著下調(P<0.05, 圖6A)。正常氧氣培養條件下，在宮頸癌細胞系SiHa中敲低Netrin-1對AKT蛋白及其磷酸化形式p-AKT沒有顯著性影響(P>0.05，圖6B)。上述結果表明，在正常氧氣培養條件下，敲低Netrin-1對PI3K/AKT通路沒有影響，但是在低氧條件下，敲低Netrin-1可以抑制PI3K/AKT通路的激活。

圖6 缺氧條件下Netrin-1通過激活PI3K/AKT通路誘導SiHa細胞上皮-間質轉化

3 討論

侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，宮頸癌患者的不良預后與侵襲及轉移相關，轉移以直接侵犯和淋巴轉移為主，晚期可轉移到肺、腎等[13]。EMT作為上皮源性腫瘤發生發展過程中的重要步驟，與腫瘤浸潤及轉移密切相關，在結直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等癌細胞中，從上皮細胞到間充質細胞的表型改變在轉移過程中起決定性作用[14-15]。盡管在診斷和篩查技術以及疫苗的使用方面有所改進，宮頸癌仍然是全世界女性與癌癥相關死亡的第二大原因。具有EMT表型的原發性宮頸癌顯示出腫瘤進展、侵襲、轉移和上皮完整性畸變[16]。缺氧是宮頸癌和其他類型癌癥患者不良臨床預后有力且獨立的指標，研究人員發現缺氧相關的蛋白質組的變化可以通過誘導EMT而增加了癌細胞的侵襲和轉移[17]。這些變化伴隨著間質標記Vimentin的上調以及上皮標記E-cadherin的下調，表明缺氧條件下宮頸癌細胞中EMT的發生。本研究證明宮頸癌細胞系SiHa、Caski經含有二氧化鈷的培養基培養24 h后，細胞中E-cadherin被顯著下調，Vimentin被顯著上調，證實發生了EMT，同時遷移及侵襲能力顯著增強，表明低氧誘導SiHa、Caski發生上皮-間質轉化，并且提高了宮頸癌細胞的侵襲及轉移能力。

Netrin-1是Netrin家族中最有特色的配體，是一種高度保守的可溶性蛋白，越來越多的證據表明，Netrin-1不僅參與中樞神經系統的發育[18]，而且在多種人類癌癥細胞中高表達，如Netrin-1在肝癌細胞中過表達，并在低氧條件下，通過激活NF-κB誘導上皮-間質轉化并促進肝癌細胞侵襲；在神經膠質瘤細胞高表達，通過UNC5A受體激活NF-κB促進神經膠質瘤的生長[19]；Netrin-1通過EMT增強細胞侵襲、遷移和血管生成模擬物，從而引發非小細胞肺癌的轉移潛力。本研究發現，相對于正常上皮細胞，Netrin-1在宮頸癌細胞系SiHa、Caski、Hela中均顯著過表達。并且經低氧條件處理后，細胞內Netrin-1蛋白表達水平提高，敲低Netrin-1可抑制由低氧誘導的宮頸癌細胞EMT過程，并使細胞的侵襲及轉移能力降低；而在常氧條件下，敲低Netrin-1對細胞EMT過程及侵襲轉移能力沒有明顯影響。這表明Netrin-1在低氧誘導宮頸癌細胞的EMT過程中發揮正向調控功能，促進細胞的侵襲及轉移。

在低氧微環境中細胞因子、趨化因子、G蛋白偶聯受體等可激活 PI3K/ AKT/MTOR、MAPK和NF-κB信號通路。PI3K/ AKT/MTOR 信號通路在大多數腫瘤細胞中處于高活性狀態，也正是因為這條通路的激活，促進了腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲。研究表明FAK是Netrin-1的重要下游分子，可在磷酸肌醇3激酶(PI3K)/ AKT和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中相互作用，從而誘導EMT[20]。此外，在周圍神經系統損傷中，Netrin-1介導的Schwann 細胞遷移與p38 MAPK和PI3K/AKT信號通路相關[21]。本研究發現通過低氧誘導SiHa細胞中AKT蛋白水平不變，p-AKT水平增加，PI3K/AKT通路被激活，在宮頸癌細胞SiHa中敲低Netrin-1后，p-AKT恢復到原來水平，AKT通路激活效應被抑制。而在正常氧氣條件下，敲低Netrin-1對PI3K/AKT通路沒有明顯影響。從而證實了低氧條件下Netrin-1通過PI3K/AKT促進宮頸癌細胞的EMT過程。

4 結論

Netrin-1在宮頸癌細胞系中異常高表達，并且低氧條件可誘導宮頸癌細胞中Netrin-1的表達升高，從而激活PI3K/AKT通路促進宮頸癌細胞的上皮-間質轉化過程。