丹酚酸B對VaD大鼠空間記憶及海馬區PSD95突觸相關蛋白影響

李小楠 舒剛明 高暢 張云霞 張瑩

(解放軍總醫院第四醫學中心干二科，北京 100081)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)的主要病因是由腦血管疾病如：高血壓、糖尿病和全身性動脈硬化等引起慢性腦缺血(Chronic cerebral hypoperfusion, CCH)導致的認知功能損害[1-2]。CCH會降低腦神經元能量，導致神經退行性病變，同時激活小膠質細胞產生活性氧和促炎性細胞因子，這些細胞因子反過來又損害神經細胞，導致腦損傷認知能力下降[3]。因此，CCH在VaD的發病機制中起著重要作用，目前雙側頸動脈閉塞引起的CCH已廣泛用于VaD模型。 丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)是丹參主要的水溶性組分之一，具有抗炎和抗氧化活性等多種藥理作用。SalB對心肌梗死、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病和神經系統疾病具有保護作用[4]。SalB具有調節糖尿病大鼠、肥胖大鼠糖脂代謝的作用[5]。然而，目前關于SalB對大鼠認知功能作用的研究鮮少。本實驗通過Morris實驗觀察SalB對VaD大鼠空間記憶的影響，同時檢測大鼠海馬組織中PSD95、NR2A/B和PSD93等突觸相關蛋白表達水平，探討SalB對VaD大鼠學習記憶障礙的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 SalB(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98% )；DCFH-DA(美國，Sigma公司)；丙二醛檢測試劑盒和乳酸脫氫酶檢測試劑盒(南京建工科技有限公司)。Nissl染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；多克隆抗體PSD95(1∶1000)、多克隆抗體PSD93(1∶1000)和多克隆抗體NR2B(美國，Bioworld Technology Inc公司)。磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(p-CREB)(1∶1000)和總CREB(t-CREB)(1∶1000)(美國，Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 動物分組 60只雄性Wistar大鼠，體質量(220±10) g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號為 SCXK(軍)2016-0002，于室溫下，在12/12 h的光/暗循環(上午8∶00燈亮)，自由獲取食物和水。將大鼠隨機分為4組：假手術組、模型組、治療組(SalB 20 mg/kg)、尼麥角林組(7 mg/kg尼麥角林，陽性對照)，每組15只。本實驗大鼠的處理符合動物倫理要求，并經醫院倫理委員會審核同意。

1.3 動物模型制備 模型組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定在手術臺上，除去頸部毛，暴露雙側頸總動脈，使用動脈夾夾住雙側頸總動脈，阻斷頸總動脈血流10 min，灌通10 min后，再夾閉阻斷10 min。血流再通后撤線，所有的肌肉和腺體都被引導回原位，切口縫合后放回籠中飼養。假手術組接受相同的手術，無雙側頸總動脈閉塞。治療組及尼麥角林組均按上述模型組方法建模，術后第7天，治療組每天灌胃SalB 20 mg/kg，尼麥角林組每天灌胃尼麥角林7 mg/kg，假手術組和模型組給予同體積生理鹽水，均連續治療6周。

1.4 水迷宮試驗 迷宮是一個直徑150 cm、高50 cm的圓形水池，它被分成四個想象的象限，水溫20～21℃。大鼠經過訓練，在西南象限找到一個淹沒在1～2 cm水中的平臺。在每個試驗中，給大鼠最長60 s的時間來尋找隱藏的平臺，并允許其在平臺上停留，每天進行4個間隔試驗，連續5 d測試。用MT-200 Morris水迷宮視頻分析系統自動記錄各組大鼠的穿越站臺次數(1 min內)、站臺象限停留時間、上臺潛伏期和上臺總路程以評價其學習記憶能力。

1.5 SalB對海馬組織氧化損傷的影響 行為學試驗后，每組取6只大鼠處死，取出海馬組織，用PBS緩沖液(pH7.4)研磨成10%的組織勻漿，4℃離心10 min，然后根據酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒說明，收集上清液用于檢測丙二醛(MDA)含量和乳酸脫氫酶(LDH)水平。使用DCFH-DA法測量活性氧(ROS)含量。

1.6 尼氏染色法觀察海馬區形態變化 行為學測試后，每組選取6只大鼠處死，將含有海馬的中段腦組織置于10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯脫蠟至水，經Nissl染色(50℃下于甲苯胺藍溶液中染色30 min)，蒸餾水沖洗，1% HCL乙醇分化30 s，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照，觀察大鼠海馬組織CA1區神經元形態。

1.7 透射電鏡觀察海馬區超微結構 各組隨機選取2只大鼠，經腹腔麻醉后，斷頭，在冰上快速分離海馬，切取1 mm3海馬CAl區組織塊，2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h，按常規制作電鏡標本，以透射電鏡觀察海馬CA1區超微結構改變。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測海馬中記憶相關蛋白水平 行為學測試后，每組選取6只大鼠處死，取出海馬組織，加入RIPA裂解液制備組織勻漿，4℃離心取上清(蛋白提取液)，分裝后-20℃保存。使用BCA試劑盒測量蛋白質濃度后，煮沸10 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移到硝化纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗(NR2A/B，PSD95、PSD93、p-CREB、t-CREB和β-actin)4℃孵育過夜，將膜清洗3次，然后二抗室溫孵育2 h。通過凝膠圖像分析系統Quantity one對蛋白質條帶進行定量分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白IOD值/內參β-actin IOD值，以假手術組相對表達量為100%。

2 結果

2.1 SalB對各組大鼠空間記憶障礙影響 與假手術組比較，模型組大鼠穿越站臺次數下降、上臺潛伏期和上臺總路程增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組或尼麥角林組穿越站臺次數增加、上臺潛伏期和上臺總路程下降(P<0.05)；各組大鼠站臺象限停留時間無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠水迷宮試驗指標比較

2.2 各組大鼠海馬組織中氧化應激指標水平變化 與假手術組比較，模型組MDA、LDH和ROS水平顯著升高(均P<0.01)。經SalB治療后，大鼠MDA、LDH和ROS水平均明顯下降(P<0.05)。而假手術組和尼麥角林組間各指標水平無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 SalB對各組大鼠海馬組織氧化應激的影響

2.3 各組大鼠腦組織中海馬區形態變化 尼氏染色法觀察顯示，假手術組海馬神經元形態正常，排列整齊，胞體完整，界線清晰。模型組海馬區神經元丟失明顯，數量減少，排列紊亂、松散，尼氏小體數量減少、體積固縮。治療組和尼麥角林組神經元排列較為整齊，大部分細胞輪廓清晰，但仍可見少量固縮不規則細胞，見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區尼氏染色(200×)

2.4 透射電鏡觀察海馬區超微結構 與假手術組相比，模型組大鼠突觸凹型、數量減少，活性帶長度縮短，突觸變的平坦；與模型組相比，經SalB治療后大鼠突觸凹型、數量增加，活性帶長度增加，突觸變得彎曲，與尼麥角林組基本相似，見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區超微電鏡(30000×)

2.5 SalB對各組大鼠海馬組織中突觸蛋白影響 Western blot檢測顯示，與假手術組比較，模型組PSD95、NR2A/B、PSD93蛋白水平及p-CREB/t-CREB比值明顯降低(均P<0.01)；經SalB治療后PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/t-CREB比值較模型組明顯上升(均P<0.01)。而假手術組與尼麥角林組比較，各蛋白水平無明顯差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 SalB對各組大鼠海馬組織中突觸相關蛋白影響

3 討論

VaD通常被認為是由腦內血管疾病引起的記憶及其他腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合征[6]，也是繼阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)之后第2位最常見的癡呆原因[7]，被稱為“二十一世紀無聲的流行病”。盡管VaD患者常出現與AD患者相似的癥狀，但VaD患者大腦中的相關變化并非歸因于 AD的病理學，而是大腦內血流的慢性減少。

SalB生物毒性低，具有抗氧化活性，在體內能夠保護血腦屏障免遭缺血再灌注損傷的影響，促進神經發生、血管再生，已被用于心腦血管疾病的治療[8-10]。但目前還沒有關于SalB改善大鼠認知功能作用的研究報道，因此本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察SalB對改善大鼠認知的作用效果，并探究其可能機制。

文獻報道，SalB可以減輕創傷性腦損傷和Aβ25-35肽誘導的AD小鼠的認知能力下降[11]。若SalB能改善CCH所致的認知功能障礙，將可能成為VaD的治療藥物。本研究水迷宮試驗顯示，與模型組比較，治療組或尼麥角林組穿越站臺次數增加，上臺潛伏期和上臺總路程下降，說明SalB治療能夠緩解大鼠的空間記憶缺陷，這為SalB可能用于治療CCH相關性癡呆記憶障礙提供了直接證據；尼氏染色觀察顯示，與假手術組相比，模型組海馬區錐體細胞丟失明顯，細胞層數和數量減少，提示VaD大鼠模型制作成功。治療組和尼麥角林組排列較為整齊、細胞輪廓清晰，說明SalB具有促進VaD大鼠海馬區神經細胞再生作用。

CHH被認為是VaD的一個危險因素，與ROS的產生密切相關[9,12]。氧化應激是促氧化劑與抗氧化劑內環境平衡失調，導致組織損害[13]。研究表明，CHH可誘導產生大量ROS，引起氧化應激反應，造成細胞損傷[10]，因此抑制氧化應激可能是VaD潛在治療方法。研究報道[14]，SalB可以減少氧化應激，對大鼠肝損傷起到保護作用。本研究中，ELISA和DCFH-DA法檢測發現模型組MDA、LDH和ROS水平均高于假手術組，提示大腦中的氧化應激可能會導致神經系統的功能障礙，包括記憶喪失。而經SalB治療后，大鼠MDA、LDH和ROS水平下降，說明丹酚酸B可能通過抑制海馬組織中氧化應激反應，減輕CCH大鼠的記憶障礙，從而發揮神經保護作用。

在AD及非AD癡呆患者腦中，突觸和突觸蛋白的丟失起著重要作用[15-18]。VaD患者顳葉皮質突觸前蛋白顯著減少(包括SNAP-25顯著減少)[19]。NMDA受體是介導突觸可塑性的主要突觸后谷氨酸受體[20]，NR2A/B為NMDA受體亞單位，而PSD93和PSD95是突觸后膜的關鍵組成部分。CREB是細胞內重要的轉錄因子，Ser133處CREB的磷酸化被認為是記憶過程的關鍵，繼而激活相應基因的啟動子、調節基因轉錄表達[21]。透射電鏡觀察發現，模型組大鼠突觸凹型、數量減少，活性帶長度縮短，突觸變的平坦，同時Western blot檢測顯示，與假手術組相比，模型組PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/ t-CREB比值均降低，提示當發生VaD時大鼠海馬突觸蛋白發生丟失；經SalB治療后，PSD95、NR2A/B和PSD93蛋白水平及p-CREB/ t-CREB比值較模型組均上升，說明SalB可能通過激活p-CREB，上調PSD95、PSD93、NR2A/B的表達促進腦缺血大鼠神經突觸的重塑，這與透射電鏡觀察發現治療組大鼠突觸數量，活性帶長度增加的結果基本一致。同時，SalB對這些突觸蛋白的解救作用還可以維持CCH大鼠的突觸功能，減輕記憶障礙。

4 結論與啟示

丹酚酸B治療能夠減輕慢性腦出血大鼠的記憶損傷，其機制可能與抑制氧化應激，恢復突觸蛋白有關。本研究發現SalB對突觸蛋白具有解救作用，為進一步研究奠定了基礎，下一步我們將對是否有其它作用機制進行探討。