黃脊竹蝗熒光定量PCR內參基因的鑒定與篩選*

方林鑫 李志紅 張守科 張 威 舒金平 王浩杰

(中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所 杭州 311400)

黃脊竹蝗(Ceracriskiangsu)是重要的森林害蟲，危害100多種竹子，分布廣、暴發頻繁，常造成重大經濟損失，制約我國竹產業健康發展(徐天森等，2004)。2020年，黃脊竹蝗飛躍中老邊境侵入我國，引發蝗災，損失慘重。利用黃脊竹蝗的“趨泥行為”誘殺成蟲是當前防治該蟲的主要手段，而明確黃脊竹蝗“趨泥行為”的發生機制是制定高效行為調控策略的關鍵(滕瑩，2012；張守科等，2017；張威等，2018)。目前，僅在行為和生理生化層面上對竹蝗“趨泥行為”的內在機制進行了探索，要進一步揭示其分子機理，基因調控層面的解析是必要的研究內容，其中相關基因的定量表達分析至關重要，但至今尚未有黃脊竹蝗內參基因篩選和鑒定方面的報道。

反轉錄實時熒光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR)具有定量準確、靈敏、通量大等優點，是驗證基因特異性表達及研究基因功能的有效方法(Yanetal.，2012；Ibanezetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。在RT-qPCR試驗中，RNA濃度、cDNA轉換效率、擴增效率等因素存在誤差且無法避免，最終影響試驗結果的準確性。為了減輕誤差因素的干擾，在檢測基因表達水平變化時常需要引入內參基因作為參照物(Radonietal.，2004；Huggettetal.，2005；Mughaletal.，2018)，借助樣品中內參基因的穩定表達量對試驗結果進行校正和標準化，以提升結果的可信度，而篩選不同試驗條件下合適的內參基因是開展相關研究的關鍵(陳孝仁等，2012；Liangetal.，2014)。理論上，內參基因應在任何試驗條件或任意部位組織細胞中均可穩定表達，并且其表達量不受任何因素影響(Kozeraetal.，2013；Jansketal.，2013)，因此內參基因一般選用傳統的管家基因，如β-肌動蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、α-延伸因子基因(EF1-α)、核糖體蛋白基因(RPS、RPL)和18S核糖體RNA基因(18SrRNA)等(S?kalskaetal.，2006；史彩華等，2016)。同時，理想的內參基因不存在假基因，具有高度特異性，與目的基因也具有相似的表達量(Wanetal.，2010；Caoetal.，2012；Ferdousetal.，2015)。但研究表明，同一種內參基因常因物種、發育條件、環境脅迫等因素的差異，其表達穩定性存在顯著差異，并不存在絕對穩定的萬能內參基因(Yuanetal.，2014；Shakeeletal.，2018)，且內參基因的穩定表達也是相對的(Lüetal.，2018)。在開展基因定量研究時，需選擇在同試驗條件下穩定表達的內參基因，且通常會選用2個或以上內參基因，以保證獲取更為準確的數據(史彩華等，2016；Shivhareetal.，2016；Shakeeletal.，2018)。本研究使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件對不同齡期、成蟲不同性別及不同組織黃脊竹蝗的內參基因進行篩選和穩定性分析，以期為黃脊竹蝗及直翅目其他昆蟲基因定量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及處理

黃脊竹蝗卵采自湖南省益陽市桃江縣竹蝗發生區(111°85′32″ E，28°42′89″ N)，置于溫室中(26 ±4 ℃，RH70%±5%)孵化，孵化后的蝗蝻轉移至2.0 m×2.0 m×2.0 m的60目大網中用2年生盆栽毛竹(Phyllostachysedulis)飼養至成蟲。對孵化前3天的卵粒，孵化后不同齡若蟲(1～5齡)及成蟲進行隨機取樣，3個重復，每重復4粒卵或4頭蝗蟲(雌、雄各2頭)。解剖成蟲頭部、觸角、唇須、精巢、卵巢和飛行肌等器官/組織樣品。所有樣品用液氮速凍，并保存于 -80 ℃冰箱中供試。

1.2 試劑及主要儀器

試劑盒：RNAprep Pure Tissue Kit(天根生化科技有限公司，中國)、FastQuant RT Super Mix(天根生化科技有限公司，中國)、2 × Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，中國)、PowerUp SYBR Green Master Mix(Applied Biosystem，美國)；化合物：β-巰基乙醇(CAS：60-24-2，中國國藥集團)；主要儀器：LifeECO-PCR儀(杭州博日科技有限公司，中國)、Q225 q-pcr熒光定量PCR儀(北京酷搏科技有限公司，中國)、SIGMA-3K15離心機(北京五洲東方科技發展有限公司，德國)、Q6000-Quawell超微量可見分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，美國)。

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

按照試劑盒說明對不同齡若蟲、成蟲不同部位進行總RNA提取，利用可見分光光度計對總RNA的質量和濃度進行檢測，樣品OD260/OD280=1.94 ～ 2.02，凝膠電泳結果均清晰可見28S與18S條帶，隱約可見5S條帶。每個樣品按照反轉錄試劑盒說明操作，對總RNA進行反轉錄，合成總cDNA。反轉錄過程采用20 μL反應體系：4 × FQ-RT Super Mix 5 μL，Total RNA 2 μL，ddH2O補充至20 μL。反轉錄步驟：42 ℃持續15 min(反轉錄反應)，95 ℃持續3 min(酶滅活過程)。總RNA于 -80 ℃低溫保存，用于合成cDNA；總cDNA于 -20 ℃低溫保存，用于RT-qPCR。

1.4 引物的設計和合成

基于黃脊竹蝗的二代和三代轉錄組測序結果，選擇了9種昆蟲常用的內參基因：TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin和18SrRNA。NCBI上檢索獲得9種內參基因序列(表1)，利用SeqHunter 2軟件在黃脊竹蝗全長轉錄組數據庫(本試驗室構建)中比對同源序列；基于同源性最高的序列，使用NCBI在線工具Primer-BLAST(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計定量PCR特異性引物(表2)，引物長度為20～22個堿基；退火溫度：18SrRNA為59 ℃，其余均為60 ℃；擴增產物長度大于90 bp、小于250 bp。引物均由浙江尚亞生物技術有限公司合成。

1.5 RT-qPCR

采用10 μL反應體系：PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物(2 μmol·μL-1)各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O補充至10 μL。qPCR采用3步標準反應模式：UDG酶激活50 ℃ 120 s；預變性95 ℃ 120 s；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s，共40個循環，熒光信號收集于延伸階段。qPCR反應結束后，立即進行溶解曲線的分析，溶解曲線條件如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s(此過程進行熒光采集)。每樣品進行3次平行技術重復，Ct值取3次結果平均值。取1齡～5齡若蟲頭部及雄性與雌性成蟲的觸角、唇須、頭部、肌肉組織和精巢/卵巢共15個組織樣品，每樣品3個重復。

1.6 標準曲線的繪制和引物擴增效率驗證

將總cDNA模板進行倍數為5的梯度稀釋，即獲得50、5-1、5-2、5-3、5-4ng·μL-1濃度的cDNA模板，按照1.5節流程進行qPCR。依據結果，以lg(cDNA模板濃度)為橫坐標，Ct值為縱坐標，利用SPSS 20軟件分析二者線性關系，估計線性方程，得到判定系數(R2)與斜率，根據公式E=(10(-1/slope)-1)× 100求得擴增效率E(Radonietal.，2004)。

1.7 數據處理及候選內參基因穩定性分析

不同組織分析時選用雄成蟲頭部、觸角、唇須、肌肉組織和精巢，不同性別分析時分別選用雌、雄成蟲頭部、肌肉、精/卵巢，不同發育期分析選用1齡～5齡若蟲。采用SPSS 20軟件對RT-qPCR所得Ct值整體進行方差分析，利用GeNorm(Vandesompeleetal.，2002)、NormFinder(Andersenetal.，2004)和BestKeeper(Pfaffletal.，2004)軟件評價9種候選內參基因在不同條件下的穩定性，進行分析與篩選。將Ct進行2-Δt轉換相對表達量，在一個內參基因中，同一條件下所有樣品Ct與最小Ct之差為Δt，再計算2-Δt，2-Δt用于GeNorm與NormFinder的分析。GeNorm通過計算會得出每個候選內參基因的M，M越小的內參基因穩定性越好，該軟件的特點是最終挑選2個或2個以上最適內參基因，內參基因個數判定值為V。當Vn/Vn+1<0.15，n取最小值時，n即為最適內參基因個數；Vn/n + 1均大于0.15時，則以最小Vn/n + 1值時的內參基因個數作為篩選標準(馬飛，2012)。NormFinder計算原理與GeNorm相似，也是通過計算獲得每個內參基因穩定值，穩定值越小，代表該內參基因表達越穩定，依據其穩定值進行排序，該軟件的特點是計算樣品間的變異，而且只篩選出一個最合適的內參基因。BestKeeper最多只能進行10個內參基因和10個目標基因表達水平的比較，將Ct輸入后，自動計算標準變異系數(SD)與差異值(P)等數據用以判定內參基因的穩定性，SD越小，該內參基因越穩定，若P大于0.05，則結果無意義，該軟件的特點是可以分析目的基因的表達水平。

2 結果與分析

2.1 9種內參基因分析與Ct值比較

參照其他昆蟲已公布序列(馮波等，2016；Dzakietal.，2017；Quetal.，2018)，篩選到9種候選內參基因的轉錄組測序結果(表1)。9種黃脊竹蝗的內參基因均首次被鑒定，與其他昆蟲相應基因序列一致性均高于70%；另外，黃脊竹蝗9種候選內參基因匹配期望值(E)為0(或近為0)，表明比對基因完全匹配，這也說明了這些內參基因的高度保守性。

表1 黃脊竹蝗內參基因比對Tab.1 Comparison with hit species on reference genes of Ceracris kiangsu

2.2 引物特異性評價與擴增效率檢驗

9種候選內參基因不同濃度梯度cDNA模板與Ct值間存在顯著的線性相關性(P<0.001，0.988 ≤R2≤ 0.998，表2)。每種內參基因RT-qPCR溶解曲線圖都呈現明顯單一峰，驗證了引物的特異性(圖1)。計算擴增效率，E均在93%～114%之間，表明RT-qPCR反應有效。

表2 候選內參基因RT-qPCR引物序列、擴增效率及判定系數Tab.2 Sequence,amplification efficiency and determination coefficient of the RT-qPCR primers for candidate reference genes

圖1 不同濃度梯度9種內參基因溶解曲線Fig.1 Melting curve of nine reference genes with different concentration gradients

2.3 9種內參基因在不同樣品中的表達水平

所有樣品RT-qPCR結果顯示，整體Ct范圍為7.54～36.22之間，各內參基因Ct值組間差異顯著(F=181.95，P<0.0001)。其中，EF1A基因Ct(30.08 ± 2.26)最大，顯著大于除AK(28.23 ± 3.45)和GAPDH(28.76 ± 1.99)外的其他候選基因(圖2)。Actin(23.55 ± 3.84)18SrRNA(10.78 ± 2.58)作為傳統的內參基因，表達豐度相對較高；除18SrRNA與Actin外，各基因Ct表達豐度均在25以上(圖2)。Actin的Ct波動最大，變異值達到13.98；GAPDH在各樣品中表達量波動最小，變異值為6.33。除AK(5.10)和Actin(6.12)外，各基因四分位差(IQR)均小于4，樣品Ct數據集中(圖2)。

圖2 9種候選內參基因在所有樣品中的CtFig.2 Ct value of nine reference genes in all samples不同小寫字母表示差異顯著(P <0.05)。Different lowercase letters mean significant difference(P <0.05).

2.4 GeNorm軟件分析

不同組織分析中，V4/5(0.323)的值最小，所以9種待選基因中有4種基因適合作為成蟲不同組織qPCR的內參基因，依照M排序依次為RPL10、TUB、GAPDH和RPS27A(圖3A)。不同性別分析與不同組織分析V的結果相似，均大于0.3，且V2/3為最小值，故RPL10與GAPDH為不同性別qPCR最適內參基因(圖3B)。在不同齡若蟲分析時，V3/4=0.149 <0.15，因此有3種基因適合作為不同齡若蟲qPCR的內參基因，依照M排序依次為RPS3、RPL10和GAPDH(圖3C)。

圖3 GeNorm軟件評價9種內參基因穩定性Fig.3 Stability of nine reference genes estimated by GeNorm softwareA：不同組織Different tissues；B：不同性別Different genders ；C：不同齡若蟲Different instars；1:TUB;2:RPS27A;3:RPL10;4:AK;5:GAPDH;6:EF1A;7:RPS27A;8:Actin;9:18S rRNA。括號內外數字表示基因穩定值一致。The two gene in and outside the round bracket mean the same stability.

2.5 NormFinder軟件分析

不同組織分析時，最穩定內參基因為GAPDH(0.320)，RPL10(0.739)次之；不同性別分析時，最穩定內參基因為GAPDH(0.318)，RPL10(0.458)次之；不同齡若蟲分析時，最穩定的2種內參基因依次為RPS3(0.107)和RPL10(0.237)(表3)。

表3 NormFinder軟件評價9個內參基因穩定性Tab.3 Stability of nine reference genes estimated by NormFinder software

2.6 BestKeeper軟件分析

不同組織分析時，穩定性最高的內參基因為RPL10，18SrRNA次之(雖然EF1A與TUB2種基因的SD比18SrRNA小，但其P均大于0.05，穩定值無意義，不適合作為內參基因)。不同性別分析時，SD最小的2種內參基因為RPL10與GAPDH，EF1A的P大于0.05，穩定值無意義，不適合作為內參基因。不同齡若蟲分析時，僅4種基因的P小于0.05，按SD由小到大依次為RPL10、RPS3、AK、Actin，可作為內參基因(表4)。

表4 BestKeeper軟件評價9種內參基因穩定性Tab.4 Stability of nine reference genes estimated by BestKeeper software

3 討論

本研究選擇昆蟲常用的內參基因在黃脊竹蝗不同發育階段、不同性別及不同組織中的穩定性進行評估，篩選出了穩定值合適的基因作為不同條件下的內參基因。首次對黃脊竹蝗9種候選內參基因(TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin、18SrRNA)進行評價驗證，發現這9種內參基因與其他昆蟲相應基因序列一致性極高，匹配差異小，是較佳的內參基因候選者，同時也進一步證明了這些內參基因在昆蟲進化中具備高度保守性。

內參基因的篩選通常采用專業軟件對候選內參基因的穩定值進行分析，并基于各軟件判定的穩定值進行綜合排序以選定合適的內參基因。大量研究結果表明，多內參基因組合較單一基因更具優勢，但過多的內參基因會造成試驗數據冗雜，使后續的基因表達量計算更為繁瑣，因此內參基因的最佳數目通常為2個(王金星等，2014；Shuetal.，2018；Wangetal.，2018)。本研究使用3個軟件對不同條件下的黃脊竹蝗內參基因穩定值進行了獨立分析，盡管各軟件的計算原理不同，但在不同條件分析時，給出穩定性排名前2位的內參基因高度重合(圖3、表3、表4)，因此2個內參基因是本研究最理想的數目，與多數學者的建議一致。

內參基因的選擇因物種或發育等條件的差異而不同。不同物種之間，最合適內參基因的選擇往往不同，GAPDH與UCCR可以作為斜紋夜蛾(Spodopteralitura)不同蟲態的內參基因(Luetal.，2013)，而金紋細蛾(Lithocolletisringoniella)不同蟲態的最適內參基因為β-TUB和β-actin(郭長寧，2014)；東亞飛蝗(Locustamigratoriamanilensis)在不同齡進行內參基因篩選時，最合適內參基因為β-actin和RP49(崔淼等，2014)。而本研究結果表明，在黃脊竹蝗不同齡若蟲階段最適內參基因組合為RPS3與RPL10(圖3、表3、表4)。除物種因素外，內參基因的選擇與蟲態和昆蟲身體組織密切相關。Zhang等(2015)研究表明棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)幼蟲的不同組織中RPS15和RPL13是最為穩定的內參基因，而成蟲的最合適內參基因為EF與RPL27。本研究結果表明黃脊竹蝗成蟲不同組織間最穩定內參基因與若蟲期最適內參基因一致，均為RPS3與RPL10。另外，性別也是影響內參基因穩定性評估的重要因素之一。馮波等(2016)發現，在松褐天牛不同性別內參基因篩選時，GAPDH與TUB是最合適的組合；對于牧草盲蝽(Lyguspratensis)，SDHA+GST的組合是不同性別成蟲穩定性最高的內參基因(賈冰等，2019)；而本研究結果顯示RPL10+GAPDH組合是黃脊竹蝗不同性別成蟲最適合的內參基因(圖3B,表3、4)。

研究表明，RPL10基因在斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、二化螟(Chilosuppressalis)等植食性昆蟲不同組織、不同種群密度飼養及不同取食條件下表達非常穩定，適合做內參基因(Luetal.，2013；徐紅星等，2019)，而本研究中，GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件分析表明，RPL10基因在黃脊竹蝗不同齡期若蟲、雌、雄成蟲及不同組織中均穩定表達(圖3B，表3、4)。不同若蟲齡分析時，基于GeNorm與NormFinder評價，RPS3是穩定性最高的內參基因(圖2、表3，表4)。RPS3的穩定性在粉莖螟(Sesamianonagrioides)、家蠶(Bombyxmori)、步甲(Carabidae)中也得到印證，可以作為特定條件下基因表達的內參基因(杜暢，2013；Luetal.，2015；劉小強等，2018)。GAPDH是參與糖酵解反應的酶，廣泛分布于各種組織中，在進化上高度保守。作為傳統的持家基因，GAPDH常常被作為內參基因用于各種昆蟲基因表達研究中。GAPDH在松褐天牛不同發育階段、不同性別的化學感受組織中表達非常穩定(馮波等，2016)；美國白蛾(Hyphantriacunea)內參基因的篩選中，在不同溫度處理下，最穩定的內參基因組合是EF1A和GAPDH(陶蓉等，2019)。本研究進一步證實了GAPDH基因的穩定性，GAPDH符合BestKeeper軟件對內參基因穩定性的要求(表4)；同時在NormFinder軟件分析不同組織與不同性別時，穩定性最高(表3)。GeNorm分析認為，GAPDH與RPL10是不同性別下基因表達研究中最合適的內參基因組合(圖3)。

4 結論

本研究首次在黃脊竹蝗轉錄組基因中鑒定9種內參基因，并成功設計這些基因RT-qPCR特異性引物。利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個軟件對這9種候選內參基因的穩定性進行評價，綜合參考3個軟件的優勢與特點，在不同組織分析時，最合適內參基因為RPL10和RPS3；在不同性別分析時，RPL10與GAPDH為穩定性最高的內參基因組合；在不同若蟲齡分析時，RPS3和RPL10是最合適的內參基因。本研究為后續黃脊竹蝗功能基因驗證及相對表達量研究奠定了基礎。