復發性流產患者微小RNA155與子宮內膜HIF-1α VEGF 微血管密度的關系

蘇 倩 凌 琳 虞紅珍 宋恩學

復發性流產是指連續發生2次及以上的自然流產，由于其病因、發生機制較為復雜，目前臨床缺乏有效的治療方法[1]。有關研究[2]發現，滋養細胞的增殖、絨毛血管新生在正常妊娠過程中發揮巨大作用。微小RNA(miR)是一種廣泛存在于生物體內的短小RNA，具有高度保守性，能參與細胞增殖及凋亡、免疫反應、腫瘤發生、器官發育等相關生理、病理過程。miR-155是重要的miR類型,溫海燕等[3]研究發現，復發性流產患者絨毛組織miR-155表達明顯失調，易受低氧因素誘導，于新生血管調控中起關鍵作用。因此，本研究分析復發性流產患者絨毛組織miR-155表達情況，并分析其與子宮內膜氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1, HIF-1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及微血管密度(microvessel density, MVD)的關系，探究滋養細胞的增殖、絨毛血管新生與miR-155表達水平異常是否有關，為進一步研究復發性流產的發生機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2020年5月在安徽醫科大學第二附屬醫院接受治療的圍植入期復發性流產患者80例納入觀察組，患者年齡23～39歲，平均(31.4±2.3)歲；胎齡53～66 d。觀察組患者均符合《復發性流產診治的專家共識》[4]中復發性流產的診斷標準；患者均無生殖道感染、染色體異常、內分泌系統疾病、生殖道結構異常、免疫系統疾病等情況。另同期選取80例正常早孕并要求終止妊娠婦女為對照組，患者年齡22～37歲，平均(31.2±2.5)歲；胎齡48～62 d。對照組所有對象經臨床檢查顯示為正常宮內早孕，且宮內胚胎發育正常；無生殖道感染、染色體異常、內分泌系統疾病、解剖結構異常、免疫系統疾病及先兆流產等情況。兩組對象的年齡、孕周、產次、胎數等基本資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組對象基本資料比較

1.2 方法 兩組對象均經清宮術獲取絨毛標本，Imag J分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，檢測miR-155、HIF-1α、VEGF、MVD水平，通過Person相關分析miR-155表達與HIF-1α、VEGF及MVD的關系。

1.2.1 miR-155水平測定 采用RT-qPCR技術檢測miR-155水平。TRlzol試劑盒購自美國Invirtogen公司，miR-155提取按照說明書進行，應用1%瓊脂糖變性凝膠對RNA完整性進行電泳檢測。操作步驟：將1 μg RNA逆轉錄為互補的DNA，即cDNA；選擇RT的反應體系：1 μg的RNA在70℃環境下進行10 min預變性，4 μL的5×RT Buffer，1 μL的酶復合物，miR-155、內參照物U6逆轉錄引物混合1μmol，并將DEPC水加到20 μL，將未包含RT酶作為對照。設置RT反應條件是：16℃(30 min)、42℃(30 min)、94℃(15 min)；選擇含對照物的RT產物1 μL作為模板，開展普通PCR，對特異性進行分析。選擇反應體系：25 μL的1×Buffer，三磷酸脫氧核苷0.1 mmol，上游引物0.4 μmol，1 μL的下游引物0.25 μL的改造后相關耐熱DNA聚合酶，將雙蒸水加到25 μL。設置PCR的擴增條件是：2 min的94℃變性后，15 s的94℃，20 s的57℃，15 s的72℃，共開展35個循環。獲取的PCR產物進行4%瓊脂糖凝膠的電泳分析。選擇總RNA(1μg)，經酶復合物的逆轉錄試劑盒進行cDNA合成后，將U6視作內參照，開展RT-qPCR檢測。設置反應條件是：92℃(2 min)、94℃(15 s)、60℃(1 min)，共開展40個循環。對標準后的miR-155具體相對表達量進行準確計算，采用2-△Ct進行表示，△Ct為CtmiR-155、CtU6差值，其中Ct值是反應實時的熒光強度明顯高于背景值時相關循環閾值。

1.2.2 HIF-1α、VEGF水平測定 采用免疫組化二步法[5]測定兩組絨毛組織內HIF-1α、VEGF水平。將鼠抗人HIF-1α抗體及VEGF抗體、內皮細胞CD34的單克隆抗體(1∶150)視作一抗，選擇免疫組化二步法進行染色，將磷酸鹽緩沖液視作一抗陰性對照；對絨毛組織內HIF-1α、VEGF分布、含量進行觀察，并用CD34對MVD進行標記。

1.2.3 MVD檢測標準 以免疫組化的陽性反應程度表示表達量，陽性單位以PU表示，PU=[Ga-Gb]/Gmax100，其中Ga、Gb表示待測的結果、背景灰度值，而Gmax為256，是檢測最大的灰度值；在每張切片上計數5個視野，將平均值視為此片MVD。

1.2.4 MVD判定標準 觀察鏡下視野顯示棕黃色血管內皮細胞、細胞簇，且管腔是>8個紅細胞構成，排除帶有肌層血管[6]。

2 結果

2.1 兩組對象絨毛組織內miR-155、HIF-1α、VEGF及MVD比較 觀察組絨毛組織內miR-155、HIF-1α、VEGF表達及MVD分布均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。兩組對象絨毛組織內HIF-1α、VEGF免疫組化染色(CD34)情況：對照組正常細胞可見棕色或棕褐色，觀察組出現淺染色或不染色情況(圖1)。觀察組鏡下MVD分布量顯著少于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

表2 兩組對象絨毛組織內miR-155、HIF-1α、VEGF及MVD水平比較

注：A是對照組的絨毛組織內HIF-1α表達；B是觀察組的絨毛組織內HIF-1α表達情況(不染色或淺染色)；C是對照組的絨毛組織內VEGF表達情況；D為觀察組的絨毛組織內VEGF表達情況(不染色或淺染色)。

對照組

2.2 患者 miR-155表達量與HIF-1α、VEGF及MVD的關系 Person相關分析顯示，患者絨毛組織內miR-155表達與HIF-1α、VEGF及MVD的相關系數r為0.544、0.574、0.642(P均<0.05)。見圖3～5。

圖3 患者miR-155表達量與HIF-1α相關性

圖4 患者miR-155表達量與VEGF相關性

圖5 患者miR-155表達量與MVD相關性

3 討論

復發性流產作為常見婦產科病癥，隨著患者的流產次數增加，其再次流產風險亦不斷升高；早期流產婦女中，復發性流產與染色體異常及生殖道生理異常因素、內分泌因素、免疫因素等多種因素有關，但部分病例仍難以明確病因，給針對性、有效性治療造成一定難度[7]。目前，臨床醫學針對復發性流產多采用注射免疫球蛋白及抗凝血等相關免疫治療為主，但少數患者治療效果欠佳。

HIF-1α活性易受氧濃度的調節[8]，其可將100多種的低氧適應性基因表達激活，主要涉及人體的血管形成及重塑、糖酵解、相關細胞增殖與凋亡、紅細胞生成等方面，在炎癥、腫瘤相關血管生成、加快腫瘤增殖與轉移、保持細胞能量代謝等方面發揮重要作用[9]。本研究結果顯示，觀察組患者的絨毛組織內miR-155表達量顯著低于對照組，且miR-155表達與HIF-1α水平呈正相關(P<0.05)。從HIF-1α作為低氧應答相關全局性調控因子來看，HIF-1α于常氧條件下穩定性較差，能通過泛素-蛋白酶解的通路被快速降解，但缺氧能對其降解進行抑制，增加HIF-1α表達，并能經激活一系列的靶基因轉錄，促使細胞適應組織低氧、營養物質供應降低情況，對細胞生存、增殖進行維持[10]；正常早孕婦女的絨毛滋養細胞在低氧情況下刺激相關細胞因子、生長因子，增加HIF-1α表達并激活，對胎盤的血管生成具有重要的促進作用。

本組資料還顯示，患者miR-155表達與VEGF、MVD水平呈正相關(P<0.05)，表明絨毛組織內miR-155表達異常可能與絨毛組織中新生血管存在密切聯系，此與王玲等[11]的研究結果較為一致。分析原因：VEGF是人體內調節血管產生的重要中樞物質，對血管內皮細胞、滋養細胞相關分裂、遷移具有促進作用，能加快新生血管形成。楊樺等[12]在相關研究中發現，早孕情況下滋養細胞由于局部氧濃度減少，機體誘導HIF-1α高表達來上調VEGF相關因子表達，能促使絨毛組織耐受缺氧。在丁輝等[13]的研究中，滋養細胞釋放的VEGF能作用在血管內皮細胞，與胎盤的血管新生、胎盤血管通透性具有密切聯系，血清中VEGF含量與子宮內膜異位癥病理分期存在明顯相關性，可輔助支持本研究結果。此外，滋養細胞的表型轉換、胎盤相關血管發育障礙易引起血管機能不全，減少血管數目，進而造成MVD下降，且絨毛的螺旋動脈、滋養層相關侵襲表淺，導致胎盤的灌注減少，引起母兒循環障礙而出現自然流產[14-15]。由于本研究只對miR-155表達與HIF-1α、VEGF、MVD進行了相關性分析，未進一步探究miR-155對以上指標的影響途徑和作用機制，尚不能明確發現miR-155對復發性流產的具體影響程度，有待今后進一步研究。

綜上所述，圍植入期復發性流產婦女子宮內膜的miR-155、HIF-1α、VEGF表達水平及MVD水平均低于正常早孕婦女，且絨毛組織miR-155與滋養細胞的增殖、新生血管異常具有密切聯系。miR-155在多種的病理及生理過程中均有一定參與作用，其表達過度對細胞增殖、MVD具有重要影響作用。