白細胞介素-22基因多態性與小兒支氣管哮喘易感性的關系分析

王 艷 楊德彬

支氣管哮喘為氣道炎癥以及氣道重塑類慢性炎癥性疾病，其中涉及多種細胞以及因子，多表現為呼吸困難、咳嗽、胸悶等癥狀，且呈現反復發作特點，在兒童群體發病率逐年上升，嚴重影響患兒健康以及發育[1-2]。研究[3]顯示，支氣管哮喘發病原因眾多，環境以及遺傳因素在發病過程中發揮重要作用，哮喘呈現出顯著遺傳易感性。基因技術發展使單核苷酸多態性逐漸成為遺傳分子研究重點，目前已知哮喘發生與1 000多個基因有關[4]。研究[5]顯示哮喘患者白介素-22 (interleukin-22, IL-22)水平高于健康人群，而IL-22基因多態性與兒童支氣管哮喘的關系尚需要進一步研究。本研究擬探究IL-22基因多態性與小兒支氣管哮喘關聯性，為今后哮喘遺傳易感性研究提供參考依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2019年6月至2021年6月鄭州大學附屬兒童醫院收治的86例支氣管哮喘患兒作為研究組，以同期在該院體檢且健康的74例兒童作為對照組。納入標準：①研究組參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中的標準[6]診斷存在支氣管哮喘；②所有兒童均完成了研究中所有檢查；③患兒家屬同意參與研究，且研究進行符合《赫爾辛基宣言》中對應倫理學標準。排除標準：①近期存在呼吸道、泌尿系統及其他部位感染；②近期應用免疫抑制劑或者糖皮質激素；③免疫系統功能異常或者合并過敏性紫癜等免疫性疾病者；④心臟、肝腎等重要器官功能異常者；⑤有過敏史或者三代直系親屬中有哮喘發病史。研究組中男性48例，女性38例，年齡3～8歲，平均(6.12±1.24)歲，身體質量指數14.5～16.8 kg/m2，平均(15.22±0.46)kg/m2，城市67例，農村19例；對照組中男性44例，女性30例，年齡3～7歲，平均(5.84±1.18)歲，體質量指數14.2～16.9 kg/m2，平均(15.15±0.63)kg/m2，城市與農村分別60例與14例。兩組研究對象一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 IL-22基因多態性分析 每例研究對象各抽取晨起空腹手肘部位靜脈血2 mL置于含有肝素鈉抗凝試管中，全血DNA抽提應用基因組DNA提取試劑盒(北京宜科思源科技有限公司)，按照試劑盒說明書進行操作，引物設計由上海生物工程有限公司負責，rs1179251位點(86 bp),上游：3’-ACCTGCATTCTAGCCCTATCTC-5’;下游：3’-AACTGGTTGGGATCTTAGCTTGTC-5’；rs2227484位點(117 bp)：上游：3’-TGCTGAATTCTAAACCAGACTTAT-5’，下游：3’-ACTTCTGCCTTAATTGTTATG ATC-5’；rs2227485位點(104bp),上游：3’-GTTTTGTCTTAGTAGAGTTCAGA-5’;下游：3’-ATAAAGCTGGTAGGAAAATGAGTC-5’。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)反應條件：95℃預變性處理10 min、95℃變性處理30 s、62℃變性處理30 s、72℃退火處理45 s，進行35個循環后，在75℃下進行10 min延伸處理。位點基因多態性應用單核苷酸多態性基因分型試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)進行檢測。

1.2.2 血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平測定 收集研究對象晨起空腹手肘部位靜脈血2 mL，離心獲得上清液，應用酶聯免疫吸附試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)測定血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.3 支氣管哮喘患兒臨床表型評估 依據研究組患兒誘導痰細胞學檢查結果，將患兒分為中性粒細胞亞組和嗜酸粒細胞亞組，參照中華醫學會呼吸病學會所提出相關標準[7]進行測定，將中性粒細胞≥61%患者歸入中性粒細胞表型組，嗜酸粒細胞≥3%患者納入嗜酸性粒細胞表型組。

1.3 觀察指標 比較兩組研究對象各位點基因型頻率觀察值與期望值，基因型以及等位基因頻率分布情況，比較兩組研究對象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平。

2 結果

2.1 兩組對象各位點Hardy-Weinbery平衡檢驗 研究組與對照組對象rs1179251、rs2227484、rs2227485基因型頻率分布符合Hardy-Weinbery平衡，位點基因型分布觀察值與期望值差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組對象各位點基因型頻率觀察值與期望值比較[例(%)]

2.2 兩組對象各位點基因型以及等位基因頻率分布情況比較 研究組患兒rs1179251位點CC、CT基因型、rs2227485位點GG基因型檢出率高于對照組(P<0.05)；兩組對象rs1179251位點TT基因型，rs2227484位點CC、CG、GG基因型，rs2227485位點GA、AA基因型檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)；兩組對象rs1179251、rs2227484、rs2227485位點等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。rs1179251位點CT基因型(OR=0.589，95%CI：0.378～0.918)、T等位基因(OR=0.658，95%CI：0.456～0.950)，rs2227485位點GA基因型(OR=0.658；95%CI：0.466～0.929)與哮喘發病風險降低有關。見表2。

表2 兩組對象各位點基因型以及等位基因頻率分布情況比較[例(%)]

2.3 兩組對象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比較 研究組患兒血清IL-22、IL-22R水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組對象血清IL-10R水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組對象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比較

2.4 不同IL-22位點基因型哮喘兒童血清指標水平比較 rs1179251位點CC基因型患兒血清IL-22、IL-22R水平高于CT+TT基因型患兒(P<0.05)，rs2227485位點GG基因型患兒血清IL-22、IL-22R水平高于GA+AA基因型患兒(P<0.05)，rs1179251位點CC基因型與CT+TT基因型患兒、rs2227485位點GG基因型與GA+AA基因型患兒血清IL-10R水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，rs2227484位點CC基因型患兒與CG+GG基因型患兒血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同IL-22位點基因型哮喘兒童血清指標水平比較

2.5 不同支氣管表型患者IL-22基因多態性分析 嗜酸性粒細胞表型組兒童rs1179251位點CC、CT基因型、rs2227485位點GG基因型檢出率高于中性粒細胞表型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同支氣管表型患者IL-22基因多態性分析

2.6 不同支氣管表型患者血清指標水平比較 血清IL-22、IL-22R水平高于中性粒細胞表型組(P<0.05)，不同表型兒童血清IL-10R比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 不同支氣管表型患者血清指標水平比較

3 討論

支氣管哮喘為兒童群體常見氣道慢性炎癥性疾病，雖然患者在接受標準療程吸入激素治療以及支氣管擴張劑治療后病情可以顯著改善，但是依然有部分患者治療效果不佳，而這一現象在兒童群體中更為顯著，導致患兒病情遷延不愈，容易反復發作[8-9]。因此，深入探究支氣管哮喘發病機制，為后期治療靶點研究提供參考十分重要。IL-22為功能多樣細胞因子，在不同疾病中可以發揮抑制或者促進炎癥反應作用，與機體疾病發生、發展以及預后有關[5]。研究[10-11]顯示，IL-22基因多態性在自身免疫性疾病以及炎癥性疾病中發揮重要作用。IL-22能夠通過激活轉錄激活因子以及Janus激酶信號轉錄轉導子信號通路，減少上皮細胞增殖、促進上皮細胞增殖，在機體免疫防御中發揮重要作用，還可以通過上調促炎因子表達而放大機體炎癥反應[12]。還有研究[13]報告IL-22基因rs1179251位點G等位基因是機體炎癥并發癥發生保護因素。一項針對人類免疫缺陷病毒感染研究[14]顯示，rs2227513 A/G 基因型與人類免疫缺陷病毒感染有關，而與rs2227484位點以及rs2227485位點多態性無關。

本研究結果顯示，rs1179251位點、rs2227485位點高于健康對照組，rs1179251位點CT基因型、T等位基因，rs2227485位點GA基因型可能與哮喘發病風險降低有關，提示rs1179251位點、rs2227485位點多態性可能與小兒支氣管哮喘易感有關。此前研究[15]顯示，IL-22與哮喘的發生關系密切，其可通過與氣道平滑肌細胞和肺泡上皮細胞結合，從而在哮喘發生過程中發揮作用。此外，研究[16]發現哮喘患者痰液以及血清中IL-22水平顯著高于健康者，提示IL-22水平高低與患者哮喘嚴重程度有關。本研究結果顯示，研究組患兒血清IL-22、IL-22R水平均高于對照組，而兩組研究對象血清IL-10R水平差異無統計學意義。 有研究[13]認為IL-22需要與IL-22R受體結合后才能被激活，因此其是否能夠發揮作用主要與靶細胞中IL-22R受體存在多少有關，而是否涉及IL-10R尚需要進一步研究證實。本研究結果與該研究[18]結論基本一致。李志等[17]研究則認為哮喘發生初始階段，IL-22會加速氣道上皮細胞壞死速度，進而抑制上皮細胞分化增殖，促進機體氣道炎癥，而哮喘發生終末階段，IL-22可能發揮保護氣道組織作用。本研究結果顯示rs1179251位點以及rs2227485位點基因型與血清IL-22、IL-22R水平關系密切，提示IL-22可能通過rs1179251位點以及rs2227485位點基因多態性，影響血清IL-22、IL-22R水平，進而介導患兒支氣管哮喘發生。研究顯示嗜酸性粒細胞長時間浸潤是支氣管哮喘發生主要原因，支氣管哮喘患者嗜酸性粒細胞異常上升顯示患者自身免疫能力減弱，機體炎癥反應激烈[18-19]。本研究結果顯示支氣管哮喘患兒臨床表型與rs1179251位點CC、CT基因型，rs2227485位點GG基因型，血清IL-22、IL-22R水平關系密切，顯示IL-22基因位點多態性以及血清IL-22、IL-22R水平在支氣管哮喘患兒臨床表型中發揮重要作用，分析認為IL-22基因位點多態性會影響下游IL-22水平，進而影響機體炎癥反應，使患兒出現不同臨床表型。

綜上，IL-22基因rs1179251位點以及rs2227485位點可能與小兒支氣管哮喘易感有關，rs1179251位點CT基因型、T等位基因，rs2227485位點GA基因型能夠降低哮喘發病風險，而rs1179251位點以及rs2227485位點多態性可能與患者血清IL-22水平、臨床表型關系密切。本研究僅證實IL-22基因rs1179251位點以及rs2227485位點多態性可能與小兒支氣管哮喘易感有關，但是其在不同地域、種族之間區別尚需要進一步研究證實，今后將增加研究樣本量，驗證IL-22基因多態性對小兒支氣管哮喘發生及進展影響。