鮑曼不動桿菌耐藥性與外排泵機制及群體信號系統基因檢測分析

帥朝霞 鐘 峰 許 巖 吳 競

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)屬專性需氧的非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界并定植在人體體表及與外界相通的呼吸道、消化道等腔道內，是造成院內感染的重要機會性致病菌[1]。通常能夠引起患者呼吸系統感染、泌尿系統感染、手術部位及侵入性操作后感染，特別是重癥監護病區的患者存在感染多重耐藥AB的風險[2-3]。根據全國細菌耐藥監測網2019年數據[4]顯示，AB對碳青霉烯類藥物的耐藥率達到56%，部分地區更是達到78.6%，同時，多重耐藥率也在逐年上升。AB的耐藥機制主要包括產β-內酰胺酶、氨基糖苷修飾酶、16S rRNA甲基化酶，以及主動外排泵機制等[5-6]。 隨著臨床多重耐藥(multidrug-resistance，MDR)、碳青霉烯類耐藥(carbapenem-resistance，CR)和泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)AB菌株，以及高致病性。高毒力的AB出現，所致的社區及院內感染暴發流行給臨床治療帶來了極大的困難，研究抗菌藥物的治療方案已成為全球公共衛生系統關注的重大問題。AB群體感應系統(quorum sensingsystem，QS)主要包括信號分子合成酶(Aba I)和轉錄調節蛋白(Aba R)，目前已有研究[7]表明AB耐藥性與QS具有相關性。同時，外排泵系統基因高表達也是AB主要的耐藥機制之一。本研究通過分析CR-AB、MDR-AB和非多重耐藥AB中主動外排泵基因ade B、ade J、abe S、abe M及QS相關基因Aba I、Aba R的分布，探討不同耐藥AB耐藥性與外排泵基因及QS系統的關系特點，為臨床制定用藥方案及院感防控提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 采集2018年1月至 2021年7月皖南醫學院第二附屬醫院臨床分離的130 株AB菌(去除同一患者同標本重復菌株)，其中痰液標本93株、肺泡灌洗液標本10 株、咽拭子標本9株、尿液標本9株、分泌物標本7株、血培養標本2株。臨床分離的AB菌株均經全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定。藥敏質控菌株：大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)，均來自安徽省耐藥監測中心。

1.2 主要儀器試劑 VITEK2 Compact 全自動細菌鑒定藥敏分析儀(法國Bio Mérieux)，凝膠成像儀、PCR 儀(美國Bio-Rad)，生物安全柜HR40-IIA2(海爾生物醫療)，雙向電泳分析儀(北京六一儀器廠)，高壓滅菌鍋(上海博迅)，PCR 反應試劑(寶生物工程)，電泳瓊脂糖(上海生工)，GN、AST-GN13(法國Bio Mérieux )。

1.3 菌株鑒定和藥敏試驗 臨床分離的130株菌株經 VITEK2-Compact 全自動細菌鑒定藥敏分析儀進行鑒定確認為AB后，按菌株的耐藥性分為多重耐藥AB組31株(23.85%)、碳青霉烯類耐藥AB組43株(33.08%)、非多重耐藥AB組56株(43.07%)。其中多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)指對3類及3類以上抗菌藥物耐藥的AB，碳青霉烯類耐藥AB(CR-AB)指對亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥的AB。

1.4 AB外排泵基因及QS系統相關基因檢測 采用煮沸法提取二次活化后細菌的DNA，接種環挑取菌落于600 μL緩沖液后震蕩混勻，100℃煮沸15 min，冷卻后離心10 min，將得到的上清液DNA濃度調整為50～100 ng/μL作為模板備用。PCR反應體系：模板2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、Premix 10 μL去離子水6 μL，總反應體積20 μL。擴增反應條件：Aba I 預變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸5 min。Aba R預變性94℃ 5 min，94℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸5 min。ade B 和ade J 預變性94℃ 5 min，95℃變性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸5 min。abe M 和abe S預變性94℃ 5 min，95℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸5 min。所用引物見表1。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳恒壓120 V，電流70 mA，30 min。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察并記錄。將擴增陽性產物送到上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果在Gene Bank 比對。

表1 AB外排泵基因及QS系統相關基因引物序列及產物大小

1.5 統計學方法 采用 SPSS 22.0進行統計分析。計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同耐藥性AB的構成比及藥敏分析結果 130株AB中，非多重耐藥Ab(56株)對測試藥物耐藥率均低于15%，其中對氨基糖苷類、碳青霉烯類、四環素類及多肽類抗菌藥物均無耐藥性。多重耐藥AB(31株)對多數抗菌藥物均出現較高耐藥率，對頭孢他啶、復方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率均大于85%，對替加環素耐藥率為14.29%，多粘菌素無耐藥性。碳青霉烯類耐藥AB(43株)對頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、環丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率較高，均超過85%，對多粘菌素無耐藥性。見表2。

表2 3組不同耐藥AB菌株藥敏分析

2.2 AB外排泵基因及群體信號系統相關基因分布 PCR檢測130株不同耐藥AB外排泵基因及群體信號系統相關基因，其中ade B檢出率為43.85%(57株)，ade J檢出率為48.46% (63株)， abe M檢出率為48.46%(63株)，abe S 檢出率為46.15%(60株) ，Aba I 檢出率為46.15%(60株)，Aba R 檢出率為48.46%(63株)。見表3。在非多重耐藥菌株中，攜帶外排泵基因及群體信號系統基因率均低于多重耐藥菌株及碳青霉烯類耐藥菌株。群體信號系統基因Aba I、Aba R在多重耐藥菌株中檢出率較碳青霉烯類耐藥菌株明顯增高，差異有統計學意義(χ2=6.049、6.188，P均<0.05)。 PCR 擴增的經瓊脂糖凝膠電泳圖見圖 1。

注：M為DNAMarker；N為陰性對照；1～4為DNA擴增陽性菌株。

表3 3組外排泵基因及群體信號系統基因分布[株(%)]

2.3 攜帶外排泵基因及群體信號系統基因AB的耐藥性分析 PCR檢測130株攜帶不同外排泵基因及群體信號系統基因的AB耐藥性均有差異，其中含有外排泵基因ade B、ade J、abe M、abe S的AB耐藥性明顯高于不含上述基因的AB，其中以頭孢菌素類耐藥率的差異最為明顯(P均<0.05)。攜帶有Aba I、Aba R基因的AB對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率較不含有該基因AB的耐藥率明顯增高，差異具有統計學意義(P均<0.01)。見表4。

表4 攜帶外排泵基因及群體信號系統基因AB的耐藥性分析

3 討論

AB是一種需氧的革蘭陰性條件致病菌，廣泛存在于醫院環境中，由于具有較強的存活力和抵抗力，臨床感染已經成為全球醫院需要解決的難題。根據全國細菌耐藥監測網2014～2019年細菌耐藥性監測報告[8]，2019年AB對亞胺培南和美羅培南的耐藥率為55.5%、57.1% ，且多重耐藥和泛耐藥的菌株分離率持續增加，同時 SENTRY 耐藥監測數據顯示，歐洲地區 1997至2016 年AB對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為 60.6%和 64.4%，AB的耐藥形勢日趨嚴重[9]，已給臨床的治療帶來了嚴峻的挑戰。多粘菌素和替加環素是治療多重耐藥乃至泛耐藥的AB的“最后防線”，但是目前多粘菌素和替加環素耐藥的AB在臨床上的分離率正逐漸升高。

目前，在AB中報道的主動外排泵系統有Ade ABC、Ade IJK、Ade FGH、Ade DE、Ade XYZ、Abe M、Abe S 等，外排泵可將已在細菌體內的藥物泵出至細菌體外，導致胞內抗生素藥物濃度降低，從而導致藥物殺菌作用減弱[10-12]。同時，細菌的群體感應系統是一種細菌之間的通信過程，使細菌能夠共同改變行為，以響應周圍微生物群落的細胞密度和物種組成的變化，AB群體感應系統主要由 Aba I(信號分子合成酶)和 Aba R(轉錄調節蛋白)構成，當前已有研究[13-16]表明，AB群體感應與其運動性、抗生素抗性、生存特性和生物膜形成有關。本研究發現，多重耐藥菌株及碳青霉烯類耐藥菌株攜帶外排泵基因ade B、ade J、 abe M 、abe S 和群體信號系統基因Aba I、Aba R明顯高于非多重耐藥組，檢測出帶有Aba I、Aba R基因的AB對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率較不含有該基因的耐藥率明顯增高，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示外排泵基因ade B、ade J、abe M、abe S及群體信號系統基因Aba I、Aba R與細菌耐藥性具有相關性。

綜上所述，本院耐藥的AB主要集中在攜帶外排泵基因及群體信號系統基因的菌株中，其中，耐碳青霉烯類菌株的群體信號系統在其耐藥性中起到重要的作用，應引起院感防控和臨床治療方面的足夠重視。