亞甲基藍在鯉體內消除規律研究

李濤 賈立平 李鋒剛 王綠洲

(陜西省水產研究與技術推廣總站，陜西西安 710086)

亞甲基藍(methylene blue，MB)屬于噻嗪類染料，在空氣中較穩定，可溶于水、乙醇、氯仿，不溶于醚類[1]。它最重要的性質是氧化還原性，在好氧菌的作用下亞甲基藍能氧化成無色亞甲基藍。此外，亞甲基藍有3種代謝物：亞甲基藍的去二甲基代謝物[天青A(azure A，AZA)]、去一甲基代謝物[天青B(azure B，AZB)]和去三甲基代謝物[天青C(azure C，AZC)][2]。隨著孔雀石綠、結晶紫等三苯甲烷類染料被禁止在水產養殖中使用，以及全國范圍“三魚兩藥”專項整治活動的開展，養殖過程和收儲運環節中違法使用硝基呋喃類藥物、孔雀石綠等禁用獸藥及其他化合物的現象明顯減少。與此同時，亞甲基藍成為1種消毒劑替代品，在水產養殖過程中被用于治療某些魚病或作為消毒劑使用[3-4]。國外有研究表明，亞甲基藍及其代謝物具有生殖毒性和“三致”作用[5-8]。目前美國食品監督管理局(food and drug administration，FDA)、歐盟96/23/EC指令和日本《肯定列表》都對亞甲基藍在水產品中的殘留量制定了檢測標準[9-10]。盡管我國《水產養殖用藥明白紙》中未將亞甲基藍列為禁用藥物，但若在水產養殖過程中違規使用，仍存在一定的安全風險。鑒于亞甲基藍會對水生動物及人體存在潛在的危害[11-18]，筆者以鯉(Cyprinuscarpio)為研究對象，探究亞甲基藍及代謝物在水產動物體內的分布和消除規律，以期為加強該藥物在水產行業的監管提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及試驗用水

試驗在陜西省水產研究與技術推廣總站西安草灘實驗基地進行。試驗用鯉購自陜西省合陽縣基地，共100尾，體質量(500±50)g，體長(27.01±1.92)cm，健康無病。試驗用水為無污染的地下水，水溫(23±2)℃，pH為8.6，溶解氧為4.6 mg/L。暫養及試驗期間24 h增氧，每天換水1次，暫養1周后進行試驗。

1.1.2 試劑及儀器

試劑：亞甲基藍、天青A和天青C純度均大于95%，天青B純度為94%(美國Sigma-Aldrich公司)；乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)，二氯甲烷、甲酸為色譜純，鹽酸羥胺、對甲苯磺酸均為分析純(國藥化學試劑有限公司)。

儀器：Accela超高效液相色譜，TSQ Quantum Access Max三重四級桿質譜儀(美國Thermo Fisher公司)；萬分之一電子天平，高速冷凍離心機，漩渦振蕩器，高速離心機，固相萃取裝置，等。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥浴

常溫下，在暫養池用15 mg/L亞甲基藍溶液對鯉進行藥浴0.5 h，藥浴后用清水沖洗干凈，將魚置于水族箱中，于給藥后0.083 h，0.25 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，1 d，3 d，5 d，8 d，12 d，15 d，30 d，60 d各時長節點分別采集肌肉、肝臟、血液等組織的樣品，每個時間點3個重復，樣品置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2 樣品采集

血液樣品采集：用干凈紗布擦干魚體，斷尾取血于離心管(事先加入0.3 mL 10 g/L的肝素鈉)內，混合均勻后冷凍離心(5 000 r/min，10 min)，取上層血漿，-18 ℃保存待測。

肌肉及肝臟樣品采集：取出整個肝臟，均質化后裝入離心管；取肌肉，切成小方塊，均質化后裝入樣品袋密封。肌肉及肝臟均置于-18 ℃保存待測。

1.2.3 樣品檢測

檢測方法參考崔瑾等[19]《超高效液相色譜—電噴霧串聯質譜法測定水產品中亞甲基藍及代謝物》中的方法。采用超高效液相色譜—電噴霧串聯質譜法同時檢測水產品中亞甲基藍及其代謝物。試樣用10 mL乙腈提取3次，并在體系中添加鹽酸羥胺、對甲苯磺酸等以提高提取效率。提取液經對丙磺酸固相萃取小柱凈化，按V(乙腈)∶V(乙酸銨，1 mol/L)=1∶1洗脫，采用Thermo Hypersil C18色譜柱，以甲醇和0.2%甲酸為流動相進行梯度洗脫分離，電噴霧離子源(ESI)正離子模式，采用選擇反應監測(SRM)掃描模式。

1.3 數據處理

藥代動力學參數采用上海中醫藥大學開發的PK Solver藥動學藥效學數據處理軟件進行分析。標準曲線和藥-時曲線圖采用EXCEL 2007進行計算和繪制。

2 結果

2.1 標準曲線、檢出限、回收率和精密度

4種物質的標準溶液質量濃度在1～1 000 g/L范圍內峰面積(Y)與濃度(X)呈良好的線性關系，相關系數均大于0.998。亞甲基藍、天青A、天青B、天青C的線性方程分別為Y=2 886.046 746X，Y=552.048 819X，Y=955.517 930X，Y=269.901 437X；平均回收率分別為92.14%～105.65%，89.23%～101.50%，87.02%～103.67%，91.37%～106.54%。日內與日間變異系數均不大于10%，檢測限為1.0 μg/kg(血液中為1.0 μg/L)。

2.2 亞甲基藍及其代謝物在血液中的分布和消除規律

試驗結果顯示(見表1～表2)，以15 mg/L的亞甲基藍浸泡鯉0.5 h后，鯉血液中亞甲基藍、天青B均有檢出，天青C痕量檢出，而天青A未檢出。其中，亞甲基藍和天青B均在0.083 h處達到最高值，峰濃度值Cmax分別為61.59 μg/L和4.97 μg/L，鯉血液中亞甲基藍(MB)、天青B(AZB)、天青C(AZC)質量濃度隨時長的變化曲線見圖1。鯉血液中，亞甲基藍5 min即達到峰值，然后緩慢下降，至24 h后低于檢測限(1 μg/L)；天青B同樣于5 min時達到最高濃度，接著迅速下降，又緩慢上升，12 h時升至第2個峰值2.34 μg/L，同樣在24 h后低于檢測限。

表1 血液中亞甲基藍、天青B、天青C的殘留量(n=3) 單位：μg/L

表2 目標物質在鯉血液中的代謝動力學參數

圖1 目標物質在鯉血液中的消除規律

2.3 亞甲基藍及其代謝物在肝胰臟中的分布和消除規律

目標物質在鯉組織中的殘留量及藥動學參數見表3～表4。亞甲基藍于1 h達到第1個峰值，Cmax為311.31 μg/kg，于12 h達到第2個峰值，Cmax為152.81 μg/kg，接著緩慢下降，直至30 d仍然有檢出；肝臟中天青A、天青B和天青C的變化規律基本上呈現先迅速上升、再緩慢下降的趨勢，直至低于檢測限。這3種代謝物均于4 h時達到最高濃度，Cmax分別為30.09、129.94和38.36 μg/kg。這說明藥浴后，亞甲基藍在鯉肝臟中逐漸轉化為天青A、天青B和天青C，其中天青B的占比最大，天青A和天青C基本相當。此外，3種物質在鯉肝胰臟組織中的殘留時間均較長。亞甲基藍在鯉肝臟中經過吸收分布消除后，直至30 d仍有檢出(15.81 μg/kg)，而天青A和天青C開始低于檢測限的時長分別為24 h(1 d)和120 h(5 d)，天青B在30 d仍然有少量檢出(4.34 μg/kg)(見圖2)。

表3 肝胰臟中亞甲基藍、天青A、天青B、天青C的殘留量 單位：μg/kg

表4 目標物質在鯉肝胰臟中的代謝動力學參數

圖2 目標物質在鯉肝胰臟中的消除規律

2.4 亞甲基藍及其代謝物在肌肉中的分布和消除規律

目標物質在鯉肌肉中的殘留量和藥動學參數見表5～表6、圖3。結果顯示，天青C僅在5 min時有檢出外(1.14 μg/kg)，其他時間點均未檢出；而亞甲基藍和天青B在肌肉中的變化規律與在血液和肝胰臟中的類似，均呈現先上升后下降的趨勢，并且均于1 h時達到最高值，Cmax分別為99.02和13.89 μg/kg。可以推論，亞甲基藍在鯉肌肉中一邊吸收，一邊代謝，迅速地轉化成天青A和天青B。

表5 肌肉中亞甲基藍、天青A、天青B、天青C的殘留含量 單位：μg/kg

表6 目標物質在鯉肌肉中代謝動力學參數

圖3 目標物質在鯉肌肉中的消除規律

在藥浴后的鯉肌肉中，亞甲基藍于1 h達峰，2 h后迅速下降至13.90 μg/kg，之后緩慢波動，至12 h后開始緩慢下降，直至30 d還有少量檢出(2.84 μg/kg)；天青A于5 min達到第1個峰值，之后緩慢波動，于1 h達到第2個峰值(2.05 μg/kg)，于12 h達到第3個峰值(2.08 μg/kg)，然后緩慢下降，至24 h開始低于檢測限；天青B于1 h達到最高峰值，之后緩慢波動，于4 h達到第2個峰值(12.00 μg/kg)，于12 h達到第3個峰值(10.59 μg/kg)，然后開始下降，72 h后開始低于檢測限。

3 討論

3.1 亞甲基藍及其代謝物在鯉血液中的動力學規律

通常以達峰時間、峰濃度值和藥-時曲線下面積來反映藥物在機體內的吸收速度和程度[20]。本研究中，鯉在質量濃度為15 mg/L的亞甲基藍溶液中浸泡30 min后，亞甲基藍和天青B在血液中的濃度迅速(0.083 h)達到峰值，說明亞甲基藍和天青B在血液中快速被吸收并代謝產生相應的代謝產物。天青B的達峰濃度為4.97 μg/L，而天青A和天青C幾乎未檢出。亞甲基藍在生物體內的代謝會產生N-去甲基化分子，其中天青B是主要的代謝產物，天青A是次生代謝產物[21]，故推測血液中的亞甲基藍能迅速地代謝為去一甲基代謝物——天青B。同時，這也說明亞甲基藍通過藥浴的方式進入血液中，并且在血液中邊富集，邊吸收，邊排泄，僅產生少量的去二甲基產物。這與對鯽、異育銀鯽及日本鰻鱺的試驗結果相一致[22-24]。結合Cmax和AUC值可以得知，亞甲基藍和天青B在鯉體內吸收迅速，且吸收程度較高，這一結果與人和狗等部分哺乳動物是一致的[25]。

3.2 亞甲基藍及其代謝物在鯉組織中的分布和消除規律

雖然在國家發布的禁用漁藥清單上，亞甲基藍沒有被列為禁用漁藥，但是亞甲基藍及其代謝物結構中確實含有與孔雀石綠一樣的高殘留的三苯甲烷結構，一旦在水產品中殘留并被人食用，同樣會導致畸形的發生。目前，關于亞甲基藍及其代謝物的研究僅限于其在水產品中殘留的檢測分析方法，而在大宗水產品組織中分布與消除規律的研究較少。本文研究了亞甲基藍及其代謝物在鯉肝胰臟和肌肉組織中的分布與消除過程，結果表明，亞甲基藍、天青A、天青B這3種噻嗪類染料在鯉肝胰臟中的濃度遠高于在肌肉中的，且殘留時間長，至第30天仍被檢出。同一時間點，肝胰臟中亞甲基藍及其代謝物的濃度均比肌肉中的要高，這可能是因為肝胰臟組織作為代謝組織，蓄積了較高濃度的亞甲基藍及其代謝物，這與其他藥物在鯉體內代謝的研究結果一致[26-31]。

3.3 亞甲基藍藥-時曲線多峰現象

本研究發現，目標物質在鯉體內吸收過程中出現不同程度的雙峰或多峰現象。藥物在魚體內吸收的雙峰現象并不少見，如喹乙醇在鯉體內的藥動學研究也發現，藥物的吸收存在雙峰或多峰現象[32]。產生雙峰或多峰現象的原因多樣，除藥物本身的脂溶性和藥物劑型等因素外，肝循環(EHC)被認為是最可能產生吸收多峰的一種機制[33]。藥物被魚類攝取后，可能以代謝物或以原形進入膽汁，而后經膽總管進入腸道，經腸道細菌水解，其中一部分被腸重新吸收，另一部分則被消除。重吸收的藥物借靜脈血流再次入肝，如此形成腸-肝循環。如果重吸收的一部分藥量足夠大，導致血藥濃度一次、再次地升高，便形成多峰。此外，不同腸段吸收的差異[34]、不規則的胃排空[35]、藥物從體循環分泌到腸腔所導致的腸分泌以及藥物制劑[36]均是導致出現雙峰曲線的因素。

4 結論

雖然在國家發布的《水產養殖用藥明白紙2020年1、2號》中未將亞甲基藍列為禁用漁藥，但是亞甲基藍及其代謝物結構中也含有與孔雀石綠一樣高殘留的三苯甲烷結構，一旦殘留在食品中被人們食用，有可能會導致畸形的發生。本研究結果表明，亞甲基藍及其代謝物主要殘留在鯉魚的可食部分，且殘留時間長，含量高。建議相關部門加強水產品中亞甲基藍及其代謝物全鏈條上的監管力度。