凡納濱對蝦弧菌病及其防治方法研究進展

李君怡 吳秋平 周疆 王梅芳 鄒記興 范蘭芬

(華南農業大學海洋學院，廣州 510642)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)隸屬于對蝦科、濱對蝦屬，原產于美洲，又稱南美白對蝦，因其具有產量高、生長快和環境適應性好等特點，現已成為世界養殖產量最高的三大蝦類品種之一。該蝦于1988年被引入我國，目前其海水養殖區域主要集中在華南、東南沿海[1]。2018年我國凡納濱對蝦的養殖產量為111.75萬t，占海水養殖蝦類產量的79.31%[2]。但隨著集約化養殖的發展和生態環境的惡化，一些環境壓力源、高毒細菌或病毒導致對蝦疾病頻繁暴發，給對蝦養殖業造成了巨大損失。在細菌性疾病中尤以弧菌病、氣單胞菌病和鏈球菌病最為常見[3]。

弧菌(Vibrio)屬于革蘭氏陰性細菌，常在海洋和河口環境中被檢測到。多數弧菌具有兼性厭氧、化能異養等特征，大多具有單生極性鞘狀鞭毛[4]。目前共發現126種弧菌和2種亞種，其中有近100種是水生環境中的土著弧菌[5]。有多種弧菌對人和動物均具有致病性[6-9]。其中霍亂弧菌(V.cholerae)引發了歷史上幾次大規?；魜y疫情暴發，給人類造成了嚴重損失[10]，而副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)能引起水生動物大量死亡，也是食源性腸胃炎最主要的病原之一[11]。據統計，從2009年到2018年，僅亞洲蝦類養殖業每年就因對蝦病害遭受高達40億美元的損失[12]。Flegel等[13]估計，蝦產量60%的損失是由感染白斑綜合征病毒(WSSV)等病毒引起的，而20%是由細菌性病害引起的，而細菌性病害主要就是由弧菌屬細菌引起的弧菌病。弧菌病因此被認為是對蝦養殖業的一個持續性的威脅。

在已知的弧菌種類中，哈維氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和霍亂弧菌是與對蝦弧菌病相關的重要病原體之一。這些病原體自對蝦養殖初期就一直存在并感染對蝦[14]?；蓟【〉奈r一般表現為生長緩慢、幼蟲變態率低、身體畸形、附件壞死、鰓呈紅色或棕色、肌肉混濁、身體發紅、游泳行為異常(觀察到蝦在池邊或水面游泳)、生物發光、黑色素化、空腸和厭食等，且環境水質的惡化與弧菌的暴發往往相輔相成[15-17]。本文分別對海水養殖中常見的哈維氏弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌這4種弧菌的研究進展及相應弧菌病的治療和預防進行綜述，以期為凡納濱對蝦養殖中弧菌病的防治和監控提供參考。

1 弧菌病原介紹

1.1 哈維氏弧菌

哈維氏弧菌是一種革蘭氏陰性菌，整個菌體呈現弧狀，只有單鞭毛，在近岸溫暖海洋環境中廣泛分布，能感染多種海洋無脊椎和脊椎動物[18]。水生動物受到該菌感染后大多會出現厭食、體表出血、眼球突出等癥狀，嚴重感染者還會出現皮膚和肌肉腐爛、鱗片脫落、脾臟膨脹等癥狀[19]。研究表明，哈維氏弧菌可以通過脂多糖[20]、外毒素[21]、溶血素[22]和蛋白酶[23]等胞外產物(extracellular products，ECP)致病。與許多弧菌一樣，哈維氏弧菌的毒力受群體感應系統的調節，該系統能夠調節毒力因子，如生物膜的形成和運動、鐵載體的產生、細胞外產物和III型分泌系統(type III on system，T3SS)[24]。在弧菌感染宿主初期，T3SS位于弧菌表面，只有在弧菌與宿主細胞接觸后才被激活，整個系統由裝置蛋白、轉位子蛋白、效應蛋白及T3SS分子伴侶構成[25]。T3SS依靠接觸宿主細胞激活，將效應蛋白注入宿主細胞，從而影響宿主正常新陳代謝及功能。保守存在于不同革蘭氏陰性菌中的T3SS，其效應蛋白存在著較多區別，會作用于不同的細胞靶蛋白，誘導不同的細胞死亡方式。對蝦哈維氏弧菌感染可表現為不同的疾病狀態，包括“鮮紅綜合征”“細菌性白尾病”“發光弧菌病”等。雖然病癥各不相同，但患病對蝦一般都會變得厭食，身體松弛，腹部角質層出現多灶性紅色斑點并伴有爛身[25]。

1.2 溶藻弧菌

溶藻弧菌常存在于海洋和河流的河口，可引發海洋中脊椎動物和無脊椎動物的弧菌病，嚴重威脅著全世界漁業和水產養殖的發展[26]。由于抗生素的濫用，在水產養殖產品和環境中廣泛存在并傳播著耐藥性細菌和抗性基因[27]。Hernández-Robles等[28]從墨西哥城一家食品市場獲得的牡蠣樣品中分離得到溶藻弧菌，表明其對抗生素具有多重耐藥性。Lajnef等[29]通過對突尼斯不同海洋生物群落(海灘水域、水產養殖場及1條寒冷季節與海水相連的河流)中分離得到69株對氨芐青霉素、卡那霉素等抗生素具有耐藥性的溶藻弧菌，這些抗性基因可以在菌株的質粒中編碼，也可以在其他菌株的染色體中編碼。在對蝦育苗期，對蝦在從無節幼體變態發育為溞狀幼體期間容易感染一種疾病，其臨床體征為不蛻皮、嗜睡、游泳行為不規律、攝食減少或食欲不振等。研究表明，溶藻弧菌是該病的主要病原體，該弧菌極易侵染溞狀幼體，且短時間內可導致幼體全部死亡[30]。

1.3 霍亂弧菌

霍亂弧菌是一種革蘭氏陰性菌，也是極易造成大規模傳染病的重要的病原體。據報道，每年感染霍亂弧菌的病例數以百萬計，而且死亡率極高[31]。作為一種重要的食源性病原菌，霍亂弧菌廣泛分布于河口、海洋沿海水域以及魚、蝦、貝類等各種軟體動物中，給人類健康和水產品質量衛生帶來嚴重的安全隱患[32]。大量的研究報道表明，目前世界各地霍亂弧菌的防治情況仍然極為嚴峻[33-34]。在對蝦養殖中期，白便綜合征(俗稱“白便病”)在南美白對蝦養殖區頻發，其典型病癥為肝胰腺腫大，嚴重者糜爛；空腸或斷腸；糞便呈白色棉線狀、有黏性并浮于水面。該病發病率高，傳染性強，對養殖對蝦的危害性很強，也對整個南美白對蝦產業鏈造成了嚴重的影響，而霍亂弧菌便是該病的主要病原菌[35]。

1.4 副溶血性弧菌

雖然霍亂弧菌的危害性很大，但是最為常見的卻是副溶血性弧菌。該菌被認為是一種重要的人類的食源性病原體。人體感染該菌的主要途徑是食用未加工或未煮熟的貝類，極少數情況下，副溶血性弧菌也會引起傷口感染[36]。研究發現，食用受到感染的水產養殖動物后，患者一般會表現出明顯的惡心、嘔吐、腸痙攣和腹瀉等胃腸道的臨床癥狀[37]。此外，副溶血弧菌引起的凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死病(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)曾給對蝦養殖業帶來巨大的災難和損失[36]。研究表明，被AHPND感染的蝦有明顯的空腸、空胃、肝胰腺發白等特征，病理學觀察發現，病蝦出現肝胰腺小管崩塌、上皮細胞嚴重脫落等癥狀，而且感染之后往往會在短期內大面積暴發蝦病，引起大規模死亡[38-39]。

2 對策與建議

2.1 噬菌體控制病原菌

早在2014年，世界衛生組織(WHO)就對抗生素抗藥性提出了警示。據報道，弧菌屬的幾個菌株均已出現抗生素抗性[40-41]，但尚未發現有效的治療方法。試驗發現，裂解性噬菌體殺死病原菌或可成為控制弧菌病的最有希望的選擇之一[42]。噬菌體是地球上最豐富的生物實體之一，在細菌的進化中發揮著重要作用[43-44]。與抗生素不同，噬菌體具有特異性，它們的應用不會干擾非目標細菌物種。此外，噬菌體具有無毒性和自我限制的特點，僅當宿主細菌存在時才會留在環境中[45]。因此，將其開發為控制耐藥性細菌的病原體是一種極為可行的策略。有研究認為，噬菌體也是一種復雜的工具。例如，可將哈維氏弧菌的毒力與溫和噬菌體聯系起來，某些噬菌體可介導哈維氏弧菌毒性，使其毒力基因轉移，將哈維氏弧菌無毒株變成有毒株[46]。

2000年，Oakey等[47]研究發現了能夠侵染哈維氏弧菌的噬菌體VHML，但這種噬菌體不適合用于噬菌體治療，因為它的存在可能會使其他幾株哈維氏弧菌具有毒力。2006年，從養蝦場水域分離到的噬菌體證明，與未感染噬菌體的幼蟲相比，感染哈維氏弧菌噬菌體的斑節對蝦單足類幼蟲的活力提高了80%[48]。這一嘗試首次證明了噬菌體的潛在用途——控制水產養殖中的弧菌病原體。隨后，有學者對不同種類的弧菌采用了相似的方法。Silva等[49]以斑馬魚(Daniorerio)幼魚為感染模型，他們發現，當細菌和噬菌體同時感染時，幼魚死亡率低于3%，而未添加噬菌體的感染幼魚死亡率為17%(但較低的死亡率也可能是因為斑馬魚不是鰻弧菌的共同宿主)。Chen等[50]從患病凡納濱對蝦的腸道和養殖廢水中分離到20株弧菌(對蝦致病菌)，并以5種病原菌為寄主分離得到了5個長尾噬菌體科(Siphoviridae)的新噬菌體，研究發現，由這5個噬菌體組成的“噬菌體雞尾酒”(即噬菌體組合物)對致病性弧菌生長有較好的抑制效果。該報道還介紹了制備“噬菌體雞尾酒”并將其應用于對蝦養殖細菌感染防控的一般工作流程。以上研究結果表明，噬菌體療法可以作為一種替代方法，以保護魚蝦類水產動物在不同生長階段受到細菌感染。但目前噬菌體療法還處于研究階段。有試驗表明，噬菌體侵染具有高度特異性，當水體中弧菌濃度降低到一定程度時，噬菌體無法再起作用。這一現象也說明噬菌體無法像抗生素一樣具有廣譜抗菌性，這也是此方法的一大缺陷所在[51]。

2.2 中草藥對細菌病的治療

為了控制養殖過程中細菌的增殖，在集約化養殖中，預防性的化學治療被廣泛應用。然而，廣譜抗菌藥的濫用導致了耐藥性細菌數量的上升，這些細菌的耐藥基因有轉移或通過病毒感染陸地動物和人類的風險[52]。過度接觸化學藥物所帶來的副作用已成為共識，并引起人們對安全并生態友好的藥物研發的關注，因此有必要探索一種非化學方法來代替化學方法。例如從植物中尋找可使用的疫苗、益生菌、免疫刺激劑和自然療法[53-54]。藥用植物現已受到了眾多研究人員的關注，相對于化學治療藥物，它們對水生動物和環境更安全[55-56]。此外，藥用植物資源豐富，易于制備，有助于投入生產應用[57]。不同作用模式的化學治療藥物和中草藥的組合具有治療許多疾病的應用潛力，藥物組合可以大大降低藥物耐藥性發展的可能性并提高療效[58]。因此，為了達到更好的預防和治療效果，許多研究人員將重點放在中藥和化學藥物的聯合使用上。Yeh等[54]用臺灣牛樟(Cinnamomumkanehirae)葉和枝提取的精油和水提取物對凡納濱對蝦進行抗菌保護作用研究，發現其有顯著的抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌的作用，其中牛樟枝的水提取物可降低凡納濱對蝦對溶藻弧菌的敏感程度，并大幅提高酚氧化酶活性和血細胞吞噬活性。李青霞等[59]采用不用方法提取五倍子的有效成分，并將提取物添加到對蝦飼料中，結果表明，添加1%的五倍子水提取物抑菌效果最好，且連續拌飼喂養5 d效果最佳。

采用中草藥防治細菌性疾病依然存在一些問題需要完善，例如已有的同種中草藥添加劑產品標準混亂。市場調查發現，不同企業開發的產品往往中草藥含量差距巨大，產品市場混亂。近年來科研工作者研究探索了大量不同種類的中草藥提取物添加劑，但是真正開發成產品的極少，主要問題是沒有完善的成果轉化條件。今后科研機構需加強與企業的合作，研發新產品[60]。

2.3 相關疫苗對細菌病的預防

目前，國內已有許多有關弧菌疫苗尤其是亞單位疫苗和滅活疫苗的研究。疫苗可以形成免疫刺激，是一種有效增強機體的疾病抵抗力和免疫力的方式[61]。丁燏等[62]采用福爾馬林的方法將溶藻弧菌滅活，從而獲得了溶藻弧菌的一種全菌疫苗，接種疫苗之后的試驗證明，這種福爾馬林滅活法得到的滅活疫苗可以顯著提高黃鰭鯛(Sparuslatus)對弧菌的抵抗力和免疫力，攻毒試驗證明，獲得免疫后，黃鰭鯛的存活率明顯提高。徐在超[61]結合其對蝦腸道菌群的高通量測序分析結果，通過冰核蛋白表面展示技術成功地搭建了WSSV的囊膜蛋白VP28表面展示系統，證明采用冰核蛋白或其他蛋白作為運載蛋白進行目的基因的表面展示，進而構建載體疫苗是具有一定可行性的。然而，開發用于商業用途的疫苗并非一蹴而就的任務，尤其是針對蝦類特有的適應性免疫方面仍有許多有待發現的地方，應進行詳細和徹底的研究，進一步了解其潛力，同時開展更多的現場試驗研究，以進一步驗證疫苗在對蝦生產中預防細菌性疾病的有效性[63]。

3 展望

弧菌作為革蘭氏陰性菌群中的一員，一直被認為是對蝦細菌病最主要的病原體?，F階段針對致病性弧菌的防治手段已開展了多方面的研究探索，其中環境友好型的防治方法越來越受到重視。生物防治手段具有無毒、綠色、環保等諸多優點，也能讓廣大消費者對水產品安全具有信心。細菌類疾病最好的治療方法就是預防感染。應激是誘發蝦病的重要因素，養殖過程中應盡可能避免蝦類產生應激反應。在生產過程中可實施有效的養殖水體管理方法和適當的消毒措施來預防病害，避免弧菌進入養殖區。同時建議通過輪捕輪放、定期換水、池塘干燥和施用石灰來減少池塘生物量，降低弧菌大面積繁殖暴發的概率[64]。在未來針對弧菌病的預防和治療的相關研究中，應當更加關注養殖環境的維護，做好對養殖水質的監測，做到預防大于治療；及時檢測在防治過程中對環境造成的危害；更加重視致病性細菌對抗生素形成的抗性基因；研發更多、更靈敏、更高效的弧菌疫苗，采取特異性較強的弧菌疫苗替代對環境產生高污染的化學抑菌方法，在高效抑菌的同時降低對水體環境的污染；采取化學藥物與中草藥搭配使用的方法，研究分離其中的一些有效成分和與抗菌抑菌有關的提取物；研制全新的高效、無毒、無污染、綠色的微生物制品，以期能夠在水產養殖弧菌病的防治方面取得突破。在發現超級細菌的情況下，噬菌體是控制致病性弧菌的十分高效又安全的手段。對于以上的一些防治手段，仍存在需要解決或完善的問題，例如制作疫苗的技術復雜性，種植和運輸中草藥的不穩定性，以及噬菌體的應用對象的廣譜性等。