雞糞和玉米秸稈混合干發酵特性及微生物多樣性研究

宋佳楠，于佳瀅，馮磊，甄簫斐，李海洋，于躍玲，李福強

（1.沈陽航空航天大學能源與環境學院，遼寧 沈陽 110136；2.沈陽航空航天大學民用航空學院，遼寧 沈陽110136；3.蘭州交通大學新能源與動力工程學院，甘肅 蘭州 730070）

0 引言

隨著化石燃料的供應緊張和環境問題的日益突出，尋找替代能源刻不容緩。生物質能源是重要的可再生能源，我國生物質的年產量居世界第一，其中農作物秸稈年產量達7億多t[1]。據農業部統計，我國每年的畜禽糞便產生量高達40億t，但綜合利用率卻不足60%[2]，[3]。雞糞中含有飼料中未被消化的35%的氮和16%的磷，處理不當會導致持久污染[4]。如果能夠合理地利用這部分生物質資源，不僅能夠對環境起到保護作用，還能夠生產沼氣等清潔能源[5]～[7]。同時，相關政策的支持也為厭氧消化技術的工程應用帶來了較大的機遇。

歐洲各國的沼氣工程發展迅速，為各國帶來了巨大的環境經濟效益。截至2010年，歐盟各國的大、中、小型沼氣工程已有將近9 000座。在隨后的幾年中，沼氣工程數量不斷增多，年平均增長約28%。伴隨著我國農村能源的逐漸匱乏，國家鼓勵發展農村沼氣工程，大中型沼氣工程迎來了快速發展期[8]。單一地對農作物秸稈或畜禽糞便進行厭氧發酵，容易產生氨化、酸化和纖維素不易降解等問題。因此，我國進行了許多關于混合干發酵的研究，如混合干發酵原料配比對產氣量的影響，溫度和pH值對產氣效率的影響等，混合干發酵將是沼氣工程的重要發展方向[9]。

針對沼氣工程運行過程中微生物學機制研究較少的現狀，本文以雞糞為底物，添加10%的玉米秸稈開展中溫連續式干發酵實驗，定期監測甲烷日產量、pH值、VFAs濃度、COD濃度和氨氮濃度等參數的變化，重點分析了發酵過程的產氣性能以及不同種類酶活性和微生物群落結構的變化，以期為雞糞與秸稈混合干發酵沼氣工程的長期穩定運行提供一定的技術支持和微生物學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以新鮮雞糞為原料，雞糞取自取自遼寧北票宏發食品有限公司旗下的東官黃古屯肉雞養殖基地，為成年白羽肉食雞的新鮮糞便。玉米秸稈取自沈陽郊區農田，為研磨后的新鮮玉米秸稈（進過鍘草機，處理后長度≤2 mm）。接種物為含水率80%的新鮮活性污泥，取自沈陽市北部污水處理廠，取回后中溫馴化24 h。

1.2 實驗方法

圖1為本實驗所用的厭氧消化裝置示意圖。該裝置主要由4聯30 L厭氧發酵罐和中央控制系統組成。實驗啟動時，雞糞與玉米秸稈的總質量為3 000 g，質量比為9：1，接種污泥的量為3 000 mL，啟動過程中的溫度設置為37±0.2℃，實驗啟動周期為20 d。實驗啟動后，通過加料（加料的雞糞和玉米秸稈質量比也為9：1）使系統內的總固體（TS）含量達到15%以上，根據產氣情況繼續加料以提高TS含量，直到系統內TS含量達到20%以上。實驗溫度為37℃，為保證實驗過程中微生物有充足的可利用營養物質，第0～30天間隔兩日加1 000 g原料，第31～90天每日加1 000 g原料，第91～103天每日加2 000 g原料。

圖1 厭氧消化裝置示意圖Fig.1 Anaerobic reaction digestion device

1.3 檢測方法

甲烷產量采用LML-1型濕式氣體流量計和GT901型甲烷氣體檢測儀進行測量；TS含量采用重量法進行測定；COD濃度采用重鉻酸鉀法進行測定；氨氮（NH4+-N）濃度采用納氏試劑分光光度法進行測定；揮發性脂肪酸（VFAs）濃度采用分光光度計比色法進行測定；pH值采用pH計進行測定；酶活采用連續法進行測定；微生物群落采用16 S rRNA測序技術進行測定。

2 結果與討論

2.1 產氣特性分析

雞糞與玉米秸稈混合干發酵的甲烷日產量和累積產量變化情況如圖2所示。

圖2 甲烷日產量和累積產量的變化情況Fig.2 The changes of daily and cumulative methane production

從圖2（a）可以看出：實驗啟動后，隨著原料的添加，甲烷日產量整體呈上升趨勢；在前30天，由于進料間隔較長，每次增加原料后，甲烷日產量均呈現出新的峰值；90 d之后的甲烷日產量均值明顯高于前期的甲烷日產量均值；在第100天左右出現了甲烷日產量最高峰，為50.32 L。隨著厭氧消化反應的繼續進行，在每次加料的間隔，雞糞與玉米秸稈的厭氧消化進入饑餓階段，消化液中可生化降解的有機物逐漸被利用，微生物可利用的營養物質消失殆盡，甲烷產量逐漸降低，直至下一次添加原料，甲烷日產量出現新的峰值。從圖2（b）可以看出，甲烷累積產量的主要變化趨勢為先快后慢，這是因為實驗后半階段的加料間隔明顯縮短且加料量增加，系統內的TS含量明顯升高，進而造成甲烷日產量和累積產量的上升。

2.2 氨氮濃度的變化情況

氨態氮是指厭氧消化液中以游離氨（NH3）和銨離子（NH4+）形態存在的氮，消化液中的氨態氮通常是由水解細菌在分解蛋白質過程中形成的，簡稱氨氮。一定濃度的氨氮可以為微生物的生長繁殖提供氮源，但是，當消化液中的氨氮濃度過高時，氨氮會通過阻礙酶的合成而抑制甲烷的產生，氨氮還會通過被動運輸的形式進入微生物細胞膜中，從而影響細胞內部質子和鉀離子的平衡，嚴重抑制厭氧微生物的活性[10]。因此，控制消化液中的氨氮濃度對提高厭氧消化效率和甲烷累積產量至關重要。雞糞與玉米秸稈混合干發酵過程中氨氮濃度的變化情況如圖3所示。

圖3 混合干發酵過程中氨氮濃度的變化情況Fig.3 The change of ammonia nitrogen concentration in the process of mixed dry fermentation

從圖3可以看出：在整個厭氧消化過程中，氨氮濃度整體上呈現出先上升后下降的趨勢；在實驗前期，隨著厭氧消化反應的進行，水解細菌對蛋白質等大分子進行分解，生成大量的氨氮，同時由于不斷加入反應物料，使得氨氮累積量逐漸上升，氨氮濃度在第37天和40天出現峰值，為1 044 mg/L；之后，隨著產甲烷古菌的活性逐漸增強，其以消化液中的氨氮作為合成自身細胞的氮源，從而導致氨氮濃度逐漸下降[11]；在整個厭氧消化過程中，氨氮濃度維持在700～1 050 mg/L，消化反應過程中無明顯的拮抗反應現象出現。厭氧消化液中的氨氮濃度是維持消化系統穩定的重要指標，若能控制氨氮濃度在適宜的范圍內，對提高甲烷產率和厭氧消化的效率有關鍵作用。

2.3 pH值和VFAs濃度的關系

pH值可以反映厭氧消化系統的酸堿狀態、水解酸化細菌和產甲烷古菌的活性。VFAs作為生物代謝的中間或最終產物而存在，其積累和消耗對厭氧消化反應有直接影響。圖4反映了雞糞與玉米秸稈混合干發酵過程中pH值與VFAs濃度的變化情況。結合圖2和圖4可以看出：甲烷日產量與pH值和VFAs濃度有密切的關系，pH值與甲烷日產量成正比，當pH值升高到最大時，甲烷日產量也相應達到峰值；而VFAs濃度與甲烷日產量和pH值成反比，VFAs濃度越高，則甲烷日產量和pH值越低。

圖4 混合干發酵過程中pH值與VFAs濃度的變化情況Fig.4 Changes of pH value and VFAs concentration during mixed dry fermentation

在實驗初期（1～6 d），水解性細菌產生水解酶把非水溶性大分子（碳水化合物、脂肪和蛋白質等）水解成可溶性的單糖、脂肪酸和氨基酸等較小分子化合物，酸化細菌將這些小分子化合物轉化成了VFAs。此時消化系統中的產甲烷古菌未完全適應環境，其利用乙酸的速率與各種產酸菌的生產速率不能達到動態平衡，產甲烷速率處于較低水平，從而導致VFAs積累，pH值降低[11]。在第7～24天，每隔兩天加料1 000 g，pH值上升至6±0.2后保持相對穩定狀態；產甲烷菌數量逐漸增加，積累的有機酸被利用，VFAs濃度先減小后逐漸累積。從第31天起，每天加料1 000 g，隨著發酵底物的增加，VFAs逐漸累積，VFAs濃度在第50天達到峰值，為19.07 mg/mL，此時pH值開始從5.87逐漸下降。在第55～78天，系統出現酸化現象，pH值較低，產氣效果較差。加入適量的NaOH調節后，pH值在第78天達到峰值，為6.8～7.3，之后趨于穩定。研究表明，甲烷菌適宜的pH值為6.8～7.8，低于6.5或高于8.0均會對其產生明顯的抑制作用。同時，過低的pH值還會降低蛋白質的生物催化效果，不利于厭氧消化反應的進行。因此，保持厭氧消化系統適宜的pH值對提高厭氧消化效率和甲烷產量至關重要。

2.4 COD濃度和不同種類酶活性的變化關系

在厭氧消化過程中，多種具有水解作用的酶會參與到厭氧消化過程中的大部分生物化學反應。消化液的COD濃度可以代表溶解在消化液中的有機物濃度，因此，根據消化液的COD濃度可以判斷厭氧消化反應器的運行狀態。本研究的發酵基質為雞糞和玉米秸稈，因此，根據雞糞和玉米秸稈組成，本文研究了厭氧消化過程中纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性變化，并分析了消化液中COD濃度的變化與這些酶活性變化的關系。圖5為雞糞與玉米秸稈混合干發酵過程中不同種類酶活性與COD濃度的變化情況。

圖5 混合干發酵過程中COD濃度和不同種類酶活性的變化情況Fig.5 Changes of COD concentration and activities of different enzymes during mixed dry fermentation

從圖5可以看出，COD濃度的總體變化趨勢為先上升后下降，這是因為實驗初期的微生物活性不高，隨著添加物料的增加，消化液中的有機物濃度逐漸增加，表現為COD濃度逐漸上升，隨著厭氧消化反應的不斷進行，微生物開始大量繁殖，有機物被微生物作為營養物質消耗，導致COD濃度有下降的趨勢。隨著厭氧消化反應的進行，各類水解細菌逐漸適應生存環境，各類水解酶的豐富度逐漸增大，水解類細菌分泌的纖維素酶和半纖維素酶在促進纖維素和半纖維素水解的同時，還可以提高植物細胞壁的溶解效率，使植物細胞內更多的內溶物通過細胞壁釋放出來，從而提高厭氧消化反應的原料利用效率[12]。從圖5還可以看出，纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的最大值分別為2.44×105，0.34，153.06，471.93，307.76 IU/L，COD濃度的最大值為110 400 mg/L；隨著厭氧消化反應的進行，這5種酶的活性逐漸降低，最后趨于穩定。在實驗后期，通過人為調控將pH值調到6.8以上并維持相對穩定狀態，此階段的進出料相對穩定，COD濃度逐漸降低，產甲烷量逐漸升高，系統內的有機質得到有效降解，VFAs濃度保持在18 mg/mL左右，產酸細菌的產酸效率與產甲烷菌對VFAs的利用效率達到相對平衡的狀態，此時的厭氧消化效率較高且較為穩定。

2.5 干發酵過程中微生物群落結構的變化情況

厭氧消化過程中水解酸化細菌和產甲烷古菌的動態平衡有利于消化反應的穩定運行。厭氧消化系統中的微生物是動態變化的，在每個時期都有其特定的優勢菌群。本實驗分別在第1（D1），5（D5），10（D10），15（D15），20（D20），30（D30），40（D40），50（D50），60（D60），70（D70），80（D80），90天（D90）對消化液進行取樣，并利用16S rRNA測序技術對發酵系統的微生物群落進行鑒定和分析。

圖6為古菌在門和屬水平的菌群相對豐度變化情況。從圖6可以看出；實驗各階段的優勢菌群均為廣古菌門（Euryarchaeota），因此，可進一步尋找廣古菌門活性最高的生存環境，并與厭氧消化的反應條件相結合，從而提高產氣量；在實驗末期，厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度增加至27%；古菌屬水平的優勢菌在初期為甲烷絲菌屬（Methanosaeta），隨著厭氧消化的進行，優勢菌逐漸演變為甲烷擬桿菌屬（Methanobacterium）和甲烷球形菌屬（Methanosphaera）。甲烷球形菌屬和甲烷擬桿菌屬為實驗過程中的主要優勢菌種，均屬于甲基營養型產甲烷古菌，主要利用H2、甲醇和乙酸等物質進行產甲烷代謝，將其轉化為CH4和CO2。甲烷絲菌屬（Methanosaeta）屬于乙酸營養型產甲烷古菌，是實驗前期的優勢菌，其相對豐度隨時間的變化而逐漸降低，且受玉米秸稈添加量的影響，主要將甲基胺或甲醇歧化為CH4和CO2，或將H2，CO2和乙酸轉化為CH4[12]。

圖6 古菌門和屬水平的菌群相對豐度變化情況Fig.6 Changes in the relative abundance of bacterial groups at the phylum and genus levels

圖7為細菌在門和屬水平的菌群相對豐度變化情況。從圖7可以看出；在反應初始階段，細菌門水平上的優勢菌為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），隨著反應的進行，變形菌門和擬桿菌門的相對豐度逐漸減少，而厚壁菌門在整個反應過程中均為優勢菌；細菌屬水平上相對豐度有所降低，沒有特別明確的優勢菌；前15天的優勢菌為乳酸菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）。第50～70天的優勢菌為乳酸菌屬，80天后的優勢菌為乳酸菌屬和厭氧球菌屬（Anaerococcus）。乳酸菌屬屬于乳桿菌目，在實驗中期的相對豐度較高，可產生乳酸和多種脂肪酶，增加厭氧消化系統的丁酸含量；厭氧球菌屬在實驗中期和后期的相對豐度較高，屬于專性厭氧菌，可以將蛋白質和葡萄糖水解為有機酸和醇類等物質。綜上可以得出，接種的污泥菌屬主要由擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門等微生物構成，該類微生物主要參與纖維素、半纖維素和蛋白質等大分子有機物的水解，對促進厭氧消化底物的水解起著重要作用，具有發酵氨基酸（半胱氨酸、亮氨酸、絲氨酸、色氨酸）產生小分子有機物的功能，這些細菌共同參與水解酸化反應，為產酸細菌提供可利用的的營養物質[13]。因此，可通過對這些細菌的進一步培養，增加其豐富度，以加速對底物中纖維素和半纖維素的水解，提高反應的產氣效率。

圖7 細菌門和屬水平TOP10菌群相對豐度變化情況Fig.7 Changes in relative abundance of TOP10 flora at the phylum and genus levels

3 結論

①雞糞與玉米秸稈混合干發酵時所表現出來的產甲烷規律，主要與物料的添加和產甲烷菌的活性有明顯關系；在一定有機負荷內，加料量越大、加料頻率越高，甲烷的日產量越高。

②在整個厭氧消化過程中，氨氮濃度表現為先上升后下降的變化趨勢，氨氮濃度沒有對厭氧微生物的生長產生拮抗作用；消化液的pH值呈現出先穩定后減小，最后上升至7±0.2并保持穩定的變化趨勢，VFAs濃度的變化趨勢為先上升后趨于穩定。

③COD濃度最大值為110 400 mg/L，纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的最大值分別為2.44×105，0.34，153.06，471.93，307.76 IU/L。

④細菌在門水平上的優勢菌為廣古菌門、厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，屬水平上各微生物的相對豐度明顯下降，沒有明顯的優勢菌。