青霉菌對秸稈復合菌系好氧發酵的影響

趙玉鑫，張鐵，，趙玉曉，華棟梁，于合龍

（1.吉林建筑大學市政與環境工程學院，吉林 長春 130118；2.齊魯工業大學（山東省科學院）能源研究所，山東省生物質氣化技術重點實驗室，山東 濟南 250014；3.吉林農業大學信息技術學院，吉林 長春130118）

0 引言

作為農業大國，我國的農作物秸稈資源極其豐富，年產量接近109t，其中玉米秸稈占42%[1]，[2]。因此，挖掘高效的分解秸稈的微生物資源、開發相應的秸稈生物處理和資源化利用技術是我國農業廢棄物資源化利用急需解決的問題[3]。好氧發酵是秸稈減量化和資源化的重要方法，通過好氧發酵可使秸稈中的木質纖維素得到有效降解，同時生成腐殖質。好氧發酵所得產物中含有大量的營養物質與腐殖質，可作為農林作物肥料和土壤調理劑。但是，秸稈中木質素、半纖維素和纖維素形成的三維空間交聯結構，限制了半纖維素和纖維素等有機質的生物轉化[4]，[5]。近年來，有關秸稈好氧發酵的研究主要集中于添加外源微生物提高秸稈好氧發酵的腐熟效果。何宙陽在玉米秸稈好氧發酵過程中添加米黑根毛霉菌和芽孢桿菌組成的復合菌系，顯著提高了發酵產物的總養分與種子發芽率[6]。李雯將纖維素降解菌劑和纖維素降解酶制劑同時添加到玉米秸稈中進行好氧發酵，結果顯示，玉米秸稈堆肥的碳、氮損失明顯降低，物料養分轉化有所提高，玉米秸稈提前18 d達到腐熟標準[7]。楊夢雅向玉米秸稈中添加低溫木質纖維素分解復合菌系，使得秸稈降解率提高到了43.65%[8]。Saritha M采用灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）對農業廢棄物進行好氧處理，使得木質素去除率可達11.6%～22.4%[9]。張秧將由枯草芽孢桿菌、米根霉、畢赤酵母菌和戊糖片球菌等組成的復合菌系接種于小麥秸稈中進行好氧堆肥，結果顯示，復合菌系顯著促進了有機物的降解，使得小麥秸稈的降解率可達24.48%[10]。

青霉菌是一種重要的木質纖維素降解菌，目前，有關青霉菌降解木質纖維素的研究主要集中于青霉菌合成漆酶和木質素過氧化物酶等木質素降解酶的機理與條件優化。在工程實際應用中，秸稈好氧發酵往往是在復雜菌群的共同作用下進行的，而對于青霉菌與其他微生物在秸稈好氧發酵過程中的相互作用，鮮有研究。因此，本文主要研究青霉菌對玉米秸稈復合菌系好氧發酵的影響以及青霉菌與其他微生物間的相互作用，為提高青霉菌在實際秸稈好氧發酵工程中的應用提供理論指導與科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈來自山東省濟南市章丘區某農田，經自然風干后備用，使用前破碎成長1～2 cm，寬2 cm的碎片，并高溫滅菌30 min。風干后玉米秸稈的含水率為7.46%，總有機碳含量為430 g/kg，全氮含量為11.2 g/kg，C/N為38.39。

好氧發酵處理所用的復合菌系為山東貝佳生物科技有限公司生產的液體有機肥發酵劑，該復合菌劑每毫升的有效活菌數≥1×1010個，具體的微生物組成如表1所示。

表1 復合菌劑的微生物組成Table 1 Composition of microorganism in compound bacterium agent

本文所用的青霉菌由華中農業大學提供，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2015757。培養基為PDA液體培養基（200 g馬鈴薯切碎煮沸15 min，用紗布過濾，將20 g葡萄糖加入濾液中，加入1 000 mL蒸餾水，121℃下滅菌30 min）。

1.2 試驗方法

1.2.1 青霉菌擴大培養

吸取2 mL青霉菌孢子懸液接種于400 mL的PDA培養液中，置于恒溫30℃，轉速為180 r/min的振蕩培養箱中培養7 d，然后離心（4℃，3 500 r/min）20 min，去除上清液；沉淀物經蒸餾水反復沖洗后加入500 mL蒸餾水定容，青霉菌菌液濃度為1×107CPU/mL。

1.2.2 試驗設計

向6個容積為1 L的錐形瓶中分別加入35 g破碎后的玉米秸稈和10 mL的復合菌系，添加0.36 g尿素調節C/N為25，對照組（CK）不添加青霉菌，另外5組分別按秸稈干重的0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%加入青霉菌懸液（分別記為V1，V2，V3，V4和V5）。各試驗組均在恒溫30℃的培養箱中靜態發酵15 d，并在第2，4，6，8，10，12，15天采集樣品進行檢測分析，每個試驗組設置3個平行。

1.3 分析方法

1.3.1 秸稈降解率的測定

采用減重法測定秸稈降解率RW，RW的計算式為

式中：W0為秸稈初始質量，g；Wn為秸稈降解n天后的質量，g。

1.3.2 木質纖維素含量及降解率的測定

將干燥后的樣品粉碎后過篩，稱取1 g左右20～30目的樣品，用ANKOMA200 i型纖維分析儀測定纖維素、半纖維素和木質素的含量及降解率[11]。

1.3.3 漆酶、木質素過氧化物酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性測定

對比三代金融危機理論可以發現：三種理論都是建立在商品經濟的基礎上，只是各自的側重點不一樣。第一代金融危機主要側重于經濟的基本面和宏觀經濟的表現；第二代金融危機比較側重危機的消極影響和公眾對經濟環境的信心崩塌；而第三代金融危機則是將側重點放在了私人部門和脆弱的金融體系上。

參考文獻[12]中的方法提取粗酶液，即取4 g樣品浸入16 mL蒸餾水，4℃靜置24 h，紗布過濾，濾液離心（4℃，8 000 r/min）10 min，取上清液；然后通過試劑盒法分別測定漆酶、木質素過氧化物酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性。試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3.4 腐殖酸含量的測定

通過腐殖酸組成修改法測定樣品的腐殖酸含量。采用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的Na4P2O7（體積比為1：1）對樣品進行浸提，取一定量浸提液用K2Cr2O7容量法測定含碳量，即總腐殖酸含量（以碳含量計）；其余浸提液采用6 mol/L的HCl溶液酸化至pH=1，充分攪拌，室溫下靜置過夜，再離心（5 000 r/min）20 min，沉淀物溶解于0.1 mol/L的NaOH溶液，用K2Cr2O7容量法測定含碳量，即胡敏酸含量（以碳含量計）；富里酸含量為總腐殖酸含量減去胡敏酸含量[7]。

1.3.5 微生物群落結構分析

使用DNA提取試劑盒提取微生物的DNA，每次提取時重復3個平行樣品試驗，將試驗取得的DNA進行混合獲得最終代表性樣品，分別對細菌和真菌進行16S rDNA和ITS擴增，并進行高通量測序。

2 結果與分析

2.1 青霉菌對玉米秸稈降解的影響

玉米秸稈降解率的變化情況如圖1所示。

圖1 玉米秸稈降解率的變化情況Fig.1 Changes of weightlessness rate in corn straw

從圖1可以看出：秸稈降解率隨著青霉菌添加量的增加而上升；前6 d的秸稈降解速率較低，V1，V2，V3，V4，V5組的秸稈降解率分別為3.51%，4.32%，5.86%，5.91%和6.22%，對照組的秸稈降解率為3.27%；在第6～12天，各組的秸稈降解速率顯著加快，當好氧發酵結束時，V1，V2，V3，V4，V5組的秸稈降解率均超過50%，分別為50.73%，52.97%，60.52%，62.80%和64.10%，對照組的秸稈降解率為47.61%；當青霉菌的添加量超過0.3%時，秸稈降解率隨青霉菌添加量的增加而升高的趨勢不明顯。

2.2 青霉菌對玉米秸稈中木質纖維素含量及降解率的影響

玉米秸稈中木質纖維素含量及降解率的變化情況如圖2所示。從圖2可以看出：各試驗組的木質素含量均呈現出先減少后增加的變化趨勢，好氧發酵結束后，對照組和V1，V2，V3，V4，V5組的木質素含量分別為21.08%，21.31%，20.92%，23.71%，23.10%，22.92%；各試驗組的纖維素含量均呈現出持續上升的變化趨勢，好氧發酵結束后，對照組和V1，V2，V3，V4，V5組的纖維素含量分別為34.34%，36.09%，38.35%，40.39%，41.39%，42.63%；各試驗組的半纖維素含量除前4 d略有升高外，整體呈急劇下降得趨勢，好氧發酵結束后，對照組和V1，V2，V3，V4，V5組的半纖維素含量分別為31.28%，29.30%，27.44%，22.60%，22.21%，21.16%。從圖2還可以看出：好氧發酵前4 d，各試驗組的木質素降解率均顯著高于纖維素和半纖維素的降解率；隨著好氧發酵的進行，纖維素和半纖維素的降解率逐漸增加，好氧發酵結束后，木質纖維素降解率的關系為半纖維素＞木質素＞纖維素；隨著青霉菌添加量的增加，木質纖維素降解率呈上升趨勢，但當青霉菌添加量超過0.3%后，木質纖維素降解率和青霉菌添加量為0.3%時沒有顯著差異。

圖2 玉米秸稈中木質纖維素含量及降解率的變化情況Fig.2 Changes of content and degradation rate of Lignocellulosic in corn straw

造成以上結果的原因可能是多數木質纖維素降解菌為兼性降解微生物，可以同時降解木質素、纖維素和半纖維素，在好氧發酵前期，纖維素和半纖維素的降解速率低于木質素的降解速率，造成秸稈中的木質素含量下降，纖維素和半纖維素含量上升。隨著好氧發酵時間的延長，木質纖維素降解屏障被打破，微生物對更容易被分解的纖維素和半纖維素的降解速率逐漸增加，從而導致秸稈中的木質素含量呈上升趨勢。青霉菌可以合成木質素降解酶，也可以合成半纖維素和纖維素降解酶，添加青霉菌有利于提高秸稈中木質纖維素的降解率，但由于木質纖維素的降解過程是復合微生物共同作用的結果，同時青霉菌與其他微生物可能存在營養競爭關系，所以當青霉菌添加量大于0.3%后，單純提高青霉菌添加量不能顯著提高木質纖維素降解率。

2.3 青霉菌對木質纖維素降解酶活性的影響

好氧發酵過程中，木質纖維素降解酶的活性變化情況如圖3所示。由圖3可知：隨著青霉菌添加量的增加，漆酶活性顯著提高，在好氧發酵第10 d，對照組和V1，V2，V3，V4，V5組的漆酶活性分別為41.80，42.02，47.60，58.45，66.40，71.06 U/mg；木質素過氧化物酶活性的變化規律與漆酶相反，即隨著青霉菌添加量的增加，木質素過氧化物酶活性呈降低趨勢，在好氧發酵第10 d，對照組的木質素過氧化物酶活性最高，為8.24 U/mg；與半纖維素降解相關的木聚糖酶活性沒有隨著青霉菌添加量的改變而發生顯著變化，在好氧發酵第10 d，各組的木聚糖酶活性均達到最高值，且均在9 U/mg以上。

圖3 好氧發酵過程中，木質纖維素降解酶的活性變化情況Fig.3 Changes of lignocellulose degrading enzymes activity during aerobic fermentation

青霉菌產漆酶的效率較高，復合菌系中的芽孢桿菌產木質素過氧化物酶的效率較高，這可能是添加青霉菌可以顯著提高漆酶活性，降低木質素過氧化物酶活性的主要原因。青霉菌的添加并沒有對木聚糖酶的活性產生顯著影響。青霉菌對秸稈降解的促進作用可能是由于添加青霉菌后提高了漆酶活性，從而提高了對木質纖維素降解屏障中木質素的破壞作用，為復合菌系中其他微生物降解轉化半纖維素和纖維素提供了有利條件。

2.4 玉米秸稈中腐殖酸含量及胡富比的變化

腐殖酸含量是影響堆肥腐熟度及其農用效果的重要因素。總腐殖酸包括胡敏酸和富里酸，其中胡敏酸分子量大、穩定性高，對土壤修復有利；富里酸分子量小、活性較大、氧化程度較高。胡富比是胡敏酸碳的質量分數與富里酸碳的質量分數的比值，可以反映堆肥的腐熟化程度，其值越高，說明堆肥的氧化及芳構化程度越高，分子結構越復雜，堆肥越穩定[13]～[15]。好氧發酵末期，玉米秸稈中總腐殖酸、胡敏酸和富里酸的含量及胡富比的變化情況如表2所示。

表2 好氧發酵末期，玉米秸稈中總腐殖酸、胡敏酸和富里酸的含量及胡富比的變化情況Table 2 Changes of content of total humic acids，humic acid，fulvic acid and ratio of humic acid to fulvic acid in corn straw at the end of aerobic fermentation

由表2可知：除對照組外，各組的總腐殖酸含量均超過了400 g/kg，當青霉菌添加量為0.3%時，總腐殖酸含量達到最高，為521.75 g/kg。胡敏酸和富里酸含量及胡富比的變化趨勢與總腐殖酸含量的變化趨勢相同，且胡敏酸和富里酸含量及胡富比均在青霉菌添加量為0.3%時達到最高，最高值分別為331.64，190.11 g/kg和1.74。

造成以上結果的原因可能是隨著降解時間的延長，木質纖維素被微生物分解轉化為結構復雜的腐殖質類物質，有機物質被分解的同時，部分富里酸也被分解，新形成的富里酸被進一步縮合成結構復雜的胡敏酸，使得胡敏酸含量增加[14]。富里酸含量的變化受到礦化和腐殖化兩者共同作用的影響，在好氧發酵末期，腐殖化作用明顯強于礦化作用，富里酸因此不斷累積。添加青霉菌能夠增強腐殖化作用，進而增強胡敏酸和富里酸的轉化效果，提高秸稈腐熟程度，但添加青霉菌也改變了微生物的群落結構，導致青霉菌添加量超過0.3%時，秸稈的腐熟程度反而降低。

2.5 微生物群落組成的變化

真菌在發酵物料的分解轉化和腐熟穩定方面具有重要作用。好氧發酵末期，真菌在門和屬水平的相對豐度如圖4所示。從圖4（a）可以看出，在好氧發酵末期，真菌群落在門水平主要為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）。子囊菌門是降解木質纖維素的主導菌門，所以在整個降解過程中的占比一直很高。擔子菌門在發酵初期的占比很低，隨著降解的進行才逐漸大量繁殖，這主要是由于擔子菌門是纖維素和木質素的主要分解菌，隨著發酵末期纖維素和木質素相對含量的再次增加，擔子菌門的占比也隨之提高。由圖4（b）可以看出，真菌群落在屬水平上主要為酵母菌（Meyerozyma）屬和鐮刀菌屬（Fusarium）。當青霉菌添加量為0.3%時，鐮刀菌屬的占比達到了84.26%，鐮刀菌屬具有較強的木質素和纖維素降解能力，在發酵末期時仍有較高的豐度。隨著部分菌屬豐度的逐漸提高，青霉菌的生長受到了抑制，但青霉菌的添加對秸稈好氧發酵復合菌系的微生物群落結構產生了顯著影響。

圖4 好氧發酵末期，真菌在門和屬水平的相對豐度Fig.4 The species composition of fungal at the Phylum and Genus level at the end of aerobic fermentation

細菌是降解纖維素和半纖維素的重要微生物種群。好氧發酵末期，細菌在門和屬水平的相對豐度如圖5所示。

圖5 好氧發酵末期，細菌在門和屬水平的相對豐度Fig.5 The species composition of bacteria at the Phylum and Genus level at the end of aerobic fermentation

從圖5（a）可以看出，在好氧發酵末期，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主導菌門，在添加青霉菌的處理組中，變形菌門的占比均遠高于對照組，而厚壁菌門（Firmicutes）則相反，其在對照組的占比高達93.57%，這說明青霉菌可提高變形菌門的占比，抑制厚壁菌門的生長。從圖5（b）可以看出，乳桿菌屬（Lactobacillus）在對照組的占比很高，為76.70%，添加青霉菌后，其占比幾乎為零；寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）在發酵末期的占比較大，且其在V3，V4，V5組的占比差別不大。

在細菌和真菌的協同作用下，秸稈中的木質纖維素大量降解。當青霉菌添加量為0.3%時，可大幅提高鐮刀菌屬和纖維菌屬兩大菌落的占比，這對于木質纖維素的降解有很大的促進作用，主導菌落占比的大幅增加可能也進一步提高了秸稈的腐熟程度。

3 結論

①添加青霉菌可以提高秸稈復合菌系在好氧發酵過程中對木質纖維素的降解，其中降解率提高最明顯的是半纖維素，其次是木質素和纖維素。但整體而言，添加量超過0.3%時，其效果與添加量為0.3%的差別不大。

②添加青霉菌可有效提高漆酶的活性，但對木質素過氧化物酶的活性有不利影響；漆酶活性隨著青霉菌添加量的增加而升高，木質素過氧化物酶活性則隨著青霉菌添加量的增加而降低；添加青霉菌對木聚糖酶活性的影響不大。秸稈中總腐殖酸、胡敏酸和富里酸的含量及胡富比均隨著青霉菌添加量的增加而增加，并在青霉菌添加量為0.3%時達到最高，繼續提高青霉菌添加量，胡富比會有所降低。

③添加青霉菌可提高擔子菌門、變形菌門和放線菌門的占比，抑制厚壁菌門的生長。但青霉菌與其他木質纖維素降解菌存在競爭關系。隨著秸稈好氧發酵的進行，青霉菌的生長逐漸處于不利地位，但青霉菌的存在改變了微生物的群落結構，促進了秸稈的降解與腐熟。