基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制*

蔡碧蓮，文亦磊

(1.廣西中醫(yī)學(xué)校，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530023)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種尚未明確病因的慢性非特異性炎性腸病，主要表現(xiàn)為腹痛、黏液膿血便伴里急后重，病變累及部位主要為結(jié)直腸黏膜層和黏膜下層。因此，治療該病的關(guān)鍵之處在于保護(hù)腸黏膜屏障、止血、修復(fù)腸壁潰瘍等。龍血竭是一種經(jīng)植物劍葉龍血樹提取的樹脂，具有活血散瘀、定痛止血、斂瘡生肌等功效[1]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療潰瘍性結(jié)腸炎原則不謀而合。但目前對龍血竭的藥理作用機(jī)制尚未深入研究，其效應(yīng)成分也未見明確的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選了龍血竭有效成分、作用靶點(diǎn)及信號通路，從而構(gòu)建龍血竭對治療潰瘍性結(jié)腸炎的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，闡明龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎的基本作用機(jī)制，以期為開發(fā)龍血竭資源并指導(dǎo)臨床應(yīng)用龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料來源 全文資料均在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)檢索得出。

1.2方法

1.2.1龍血竭有效成分潛在靶點(diǎn)的篩選 以“龍血竭”為檢索詞，在TCMSP、PubChem檢索其所含的有效成分及所對應(yīng)潛在靶點(diǎn)，以口服利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件之一，剔除其中重復(fù)項(xiàng)及非人源的靶點(diǎn)，最終獲得龍血竭有效成分相關(guān)的靶點(diǎn)信息。

1.2.2潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“潰瘍性結(jié)腸炎”為檢索詞進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的檢索，并對重復(fù)項(xiàng)進(jìn)行剔除，取“Relevance score”在前200個疾病相關(guān)最高的靶點(diǎn)。

1.2.3龍血竭與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 將“1.2.1”項(xiàng)獲得的龍血竭有效成分潛在靶點(diǎn)與“1.2.2”項(xiàng)獲得的潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Venny2.1交集比對分析，提取共同的靶點(diǎn)，采用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析進(jìn)一步明確龍血竭有效成分的潛在靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎疾病靶點(diǎn)的關(guān)系。

1.2.4龍血竭對潰瘍性結(jié)腸炎作用靶點(diǎn)的GO富集分析及KEGG富集分析 將上述靶點(diǎn)的簡稱以Gene Symbol格式上傳至David數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO富集分析、KEGG富集分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過GO富集分析探討龍血竭有效成分治療潰瘍性結(jié)腸炎潛在作用靶點(diǎn)的生物過程、分子功能、細(xì)胞成分等；KEGG富集分析探討龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎作用潛在靶點(diǎn)的通路分布。

1.2.5龍血竭“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 在Cytoscape軟件中用不同顏色和形狀代表有效化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、作用通路等。用“邊”連接有效化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)，以及作用靶點(diǎn)和其注釋的相關(guān)作用通路，由此構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)探討龍血竭多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1龍血竭有效成分及有效成分潛在靶點(diǎn) 龍血竭主要化合物有黃酮類、查耳酮類、多聚查耳酮類、黃烷類、高異黃烷類等多種化合物。但以O(shè)B≥30%、DL≥0.18和Lipinski原則為標(biāo)準(zhǔn)最終篩選出14種化合物，其潛在作用靶點(diǎn)及數(shù)量見表1。龍血竭有14種化合物、90個作用靶點(diǎn)，得出以下結(jié)論：(1)龍血竭具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)；(2)在不同的化合物中可能存在相同的作用靶點(diǎn)。此網(wǎng)絡(luò)涉及的節(jié)點(diǎn)數(shù)為91個，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊數(shù)為710條，平均節(jié)點(diǎn)度為15.6，聚類系數(shù)為0.592。

表1 龍血竭的化合物及潛在作用靶點(diǎn)

續(xù)表1 龍血竭的化合物及潛在作用靶點(diǎn)

2.2潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)與龍血竭靶點(diǎn)比較 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫初步篩選出4 356個疾病候選基因，根據(jù)“Relevance score”讀取最高的前200個結(jié)果，與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)進(jìn)行比對，得出龍血竭與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)發(fā)病機(jī)制的17個作用靶點(diǎn)基因，進(jìn)一步說明了龍血竭與潰瘍性結(jié)腸炎的靶向作用關(guān)系。龍血竭成分靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)韋恩圖見圖1。從龍血竭有效成分對潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可知，聚類系數(shù)為0.825，平均節(jié)點(diǎn)度為11.765，平均最短路徑為1.625，其中17個重疊靶點(diǎn)是該藥與疾病作用的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)，并在關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)了較好的連通特性。

圖1 龍血竭成分靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)韋恩圖

2.3龍血竭對潰瘍性結(jié)腸炎作用靶點(diǎn)的GO分析和KEGG分析 采用David數(shù)據(jù)庫篩選龍血竭對治療潰瘍性結(jié)腸炎主要涉及的內(nèi)容為生物過程25個，包括一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞氧化解毒、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；細(xì)胞組成13個，包括細(xì)胞外、血小板α顆粒內(nèi)腔、高爾基體、內(nèi)體腔、胞外區(qū)等；分子功能16個，包括血紅素結(jié)合、受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū) DNA 結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶活性等，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。采用David數(shù)據(jù)庫篩選龍血竭對治療潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)信號通路，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，龍血竭中90個潛在作用靶點(diǎn)涉及缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路、腫瘤信號通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(FoxO)信號通路、炎癥性腸病信號通路、HTLV-I感染、脂肪細(xì)胞中脂解的調(diào)節(jié)、產(chǎn)生免疫球蛋白A的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等25條通路。

2.4龍血竭“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點(diǎn) 采用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，從該網(wǎng)絡(luò)可知，龍血竭預(yù)測出的14種有效成分，14種有效成分預(yù)測出的90個潛在靶點(diǎn)，90個潛在靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎的25條交集通路。該網(wǎng)絡(luò)涉及129個節(jié)點(diǎn)，514條邊，平均最短路徑為3.62，平均節(jié)點(diǎn)度為3.98，平均中心接近度為0.29，網(wǎng)絡(luò)中心度為4.05。

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展受多種因素、多種細(xì)胞和多條信號通路的調(diào)控而形成的復(fù)雜生物學(xué)過程[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過篩選藥物活性成分、靶點(diǎn)，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)；對疾病發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)核查對比，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)；并構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的體系。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從傳統(tǒng)的“單靶點(diǎn)、單通路”的研究角度轉(zhuǎn)變?yōu)椤岸喑煞帧⒍喟悬c(diǎn)、多通路”的研究理念與方法[3]。從而闡明中藥成分、靶點(diǎn)、疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為中醫(yī)藥科學(xué)內(nèi)涵提供了理論依據(jù)及新的研究思路。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效成分和藥物靶點(diǎn)蛋白，并與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的靶點(diǎn)核查對比的靶點(diǎn)而得到的交互蛋白，從而構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。通過篩選得到的這些蛋白——IL-6、SMAD3、STAT3、干擾素均與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)。并且在KEGG富集通路分析所獲取的“成分-靶點(diǎn)-通路”中，通過查閱文獻(xiàn)可知，這些通路與炎性反應(yīng)有直接或間接的關(guān)系，作者考慮龍血竭主要通過影響這些炎癥通路，從而發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。此外，近年來對潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的信號通路的研究表明，與潰瘍性結(jié)腸炎具有相關(guān)性的通路有腫瘤信號通路[4-5]、炎癥性腸病信號通路[6-7]、HIF-1信號通路[8-9]、FoxO信號通路[10]、腫瘤壞死因子信號通路[11]、Jak-STAT信號通路[12]和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路[13]。

作為一種輔助性T淋巴細(xì)胞1型促炎性細(xì)胞因子的IL-6，是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌的，在免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等過程中具有重要作用。IL-2作為其中的一種抑炎性細(xì)胞因子，通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化、增殖，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化、增殖，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，延緩或阻止?jié)冃越Y(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展。原本靜息態(tài)的信號傳導(dǎo)蛋白和STAT3在某些因素的刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨疭TAT3，是潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展不可或缺的重要分子，若活化STAT3出現(xiàn)過表達(dá)還可使炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)化[14]。有研究通過三硝基苯磺酸/乙醇法構(gòu)建了大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，治療組予以甘草瀉心湯各劑量灌胃治療，與模型組比較，甘草瀉心湯各劑量組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均降低，甘草瀉心湯中劑量組結(jié)腸組織病理評分明顯降低，結(jié)腸組織中IL-6、STAT3蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明甘草瀉心湯可能是通過降低結(jié)腸組織中IL-6、STAT3的表達(dá)，抑制IL-6/STAT3信號傳導(dǎo)通路，改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸結(jié)構(gòu)[15]。翟月華等[8]觀察了自擬清腸愈瘍湯經(jīng)驗(yàn)方口服、中藥灌腸對重度潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群、血清HIF-1α、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、β-內(nèi)啡肽(β-EP)水平的影響。結(jié)果顯示，觀察組患者血清HIF-1α、TGF-β1、β-EP水平降低程度明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明重度潰瘍性結(jié)腸炎患者經(jīng)自擬清腸愈瘍湯經(jīng)驗(yàn)方口服、中藥灌腸進(jìn)行中醫(yī)內(nèi)外合治能改善其臨床癥狀?？紤]可能是與抑制血清HIF-1α、TGF-β1、β-EP過表達(dá)而實(shí)現(xiàn)修復(fù)腸黏膜上的潰瘍，使之愈合并恢復(fù)其屏障功能。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得知，龍血竭有14種有效成分可直接或間接地作用于IL-6、SMAD3、STAT3、干擾素等90個核心靶點(diǎn)，并富集到腫瘤信號通路、炎癥性腸病信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Jak-STAT信號通路和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路上，相互協(xié)調(diào)，通過多種途徑發(fā)揮保護(hù)腸黏膜和修復(fù)腸壁潰瘍的作用。本研究初步揭示了龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎可能的網(wǎng)絡(luò)，為龍血竭治療潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法也存在著一定的局限性，如非核心靶點(diǎn)是否具有藥理作用、龍血竭在體內(nèi)代謝產(chǎn)物是否對作用機(jī)制有影響均有待于下一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。