紡織品霉變微生物的分離純化與鑒定

陶婭妃 張嫄 周椿浩 胡蕓 孫付保 劉建立

摘要： ?為了確定霉變棉織物上霉變微生物的種類，文章采用PDA培養(yǎng)基劃線分離純化，從霉變棉織物上得到5種霉菌，然后采用真菌形態(tài)學和顯微形態(tài)學進行了初步鑒定。結果表明，引起棉織物霉變的微生物主要為曲霉屬霉菌、青霉屬霉菌和根霉屬霉菌，其中曲霉屬占比60 % ，為棉織物致霉的優(yōu)勢菌屬。通過對純化后的霉菌進行18S rDNA-ITS序列分析，并在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫里比較序列同源性，鑒定為5個種，分別為謝瓦式曲霉、指狀青霉、聚曲多霉、米根霉和黑曲霉。文章利用形態(tài)學方法結合ITS序列分析鑒定霉菌種類，使得獲取結果更加快速和精準，為紡織品防霉基礎研究與抗霉材料研發(fā)提供參考。

關鍵詞： ?棉織物;霉菌;形態(tài)學;序列分析;純化與鑒定

中圖分類號： TS117.6

文獻標志碼： A

文章編號： 1001 7003（2022）03 0040 05

引用頁碼： 031106

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2022.03.006 （篇序）

在日常生活中，服裝不可避免地要接觸各種各樣的細菌和真菌，微生物污染是導致服裝損壞的主要原因之一。紡織材料屬于多孔材料，具有表面積大、孔隙多等特點，使其更容易吸附微生物? [1] 。人體分泌的代謝物，如汗液、皮脂為微生物提供了營養(yǎng)源，使得微生物能夠迅速繁殖和生長? [2-3] 。因此，服裝在日常生活環(huán)境中很容易被空氣中的微生物所污染，在多雨潮濕的氣候里，則更容易滋生霉菌。霉菌能夠將含有碳、硫等營養(yǎng)源的棉、毛和絲纖維分解為養(yǎng)分，促進其快速繁殖和生長。同時，霉菌在生長過程中會分泌有機酸和色素對紡織品造成酸蝕和顏色污染，影響其機械性能和美觀，縮短了紡織品的使用壽命? [4] 。

紡織品上的微生物包括細菌和真菌，目前紡織品抗菌主要針對的是細菌，對于紡織品抗真菌的研究較少，而真菌是紡織品生物降解過程中最重要的微生物? [5-6] 。紡織品上霉菌菌種的鑒定一直基于形態(tài)學特征，包括宏觀和微觀，只能鑒定到霉菌屬，這些方法通常耗時且不準確。本文利用形態(tài)學方法結合ITS序列分析鑒定霉菌種類，可鑒定到霉菌菌種，使得獲取結果更加快速和精準?？椢锉砻娴拿咕c空氣中的霉菌真菌種類密切相關，織物霉變是空氣中的霉菌對織物基質選擇的結果。方治國等? [7] 對城市室內(nèi)外空氣真菌群落的研究表明，空氣中優(yōu)勢真菌為枝孢屬、鏈格孢屬、青霉屬、曲霉屬和無孢菌等;楊靖? [8] 對徐州市城區(qū)不同季節(jié)、晝夜24 h空氣中霉菌群落組成變化和分布特點進行了研究，觀察到曲霉屬和青霉屬為優(yōu)勢霉菌群落。本次分離出的霉菌菌屬均屬于文獻[7-8]報道的空氣真菌，優(yōu)勢菌屬與空氣中優(yōu)勢真菌菌屬也基本一致。唐歡等? [9] 從館藏紙質書畫文物上分離出8株分屬于曲霉屬、根霉屬和木霉屬的霉菌; 宋賢沖等? [10] 從廣西南寧霉變的纖維板上分離出茨木霉、深綠木霉和孢脈孢霉;唐長波等? [11] 從污染絲綢織物中分離出根霉屬、曲霉屬和擬青霉屬霉菌，不同基質和環(huán)境條件下分離出的霉菌存在差異。因此，需要鑒定污染紡織品上的微生物種類，并針對這些微生物的生理生化特征，采取相應的物理、化學方法抑制其在織物表面的生長，以保護紡織品，延長其使用壽命。本文從霉變棉織物上提取霉菌，并在PDA培養(yǎng)基上劃線分離純化，得到了單一的菌株，再采用顯微形態(tài)學觀察與ITS序列分析相結合的方法對霉變微生物進行鑒定，確定了棉織物致霉優(yōu)勢菌屬，然后可根據(jù)其生長規(guī)律和生理生化特性，開發(fā)相應的防霉試劑。

1 實 驗

1.1 材料與設備

1.1.1 材 料

霉變織物：以肉眼可見的霉變?yōu)闃藴?，于江蘇省無錫市江南大學紡織科學與工程學院D區(qū)實驗室中采集的霉變棉織物（平紋，18.5 tex×18.5 tex，510根/10 cm×275根/10 cm， 148 g/m 2 ;中恒大耀紡織科技有限公司）。

PBS緩沖液：5.155 2 g Na 2HPO 4·12H 2O，0.876 3 g NaH 2PO 4·2H 2O（中國醫(yī)藥集團有限公司），1 000 mL蒸 餾水。

PDA培養(yǎng)基：40.1 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基干粉（中國醫(yī)藥集團有限公司），1 000 mL蒸餾水，加熱溶解? [12] 。

上述培養(yǎng)基及試劑均采用121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于分離鑒定霉變棉織物上的霉菌。使用乳酸石炭酸棉藍（福州飛凈生物科技有限公司）給霉菌染色并觀察其微觀 形態(tài)。

1.1.2 設 備

DZF-6050型真空干燥箱、BSD-YF2200型立式雙層精密搖床、YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司），NU-425-400S型生物安全柜（美國Nuaire公司）、 MJ-1608-Ⅱ型 霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、VHX-5000超景深三維數(shù)碼顯微鏡（基恩士公司）。

1.2 方 法

1.2.1 霉變微生物的分離純化

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》中霉菌分離純化的方法。稱取霉變棉織物10 g，置于90 mL PBS溶液中，（28±2） ℃、180 r/min條件下于搖床震蕩培養(yǎng)24 h制成1 ︰ 10菌液，依次稀釋10倍梯度，共稀釋6個梯度。各梯度均吸取1 mL菌液，并用無菌玻璃棒均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，（28±2） ℃、85 % ?RH條件下于霉菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d。從平板上長出的菌落中挑取少量菌絲，劃線接種于PDA培養(yǎng)基上，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。根據(jù)菌落的形態(tài)、大小及顏色，挑選不同的單菌落接種于PDA培養(yǎng)基中純化3次，得到形態(tài)單一的菌落，最后接種試管斜面，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落形態(tài)觀察

利用無菌接種針挑取少量純化后的菌落菌絲，在PDA培養(yǎng)基平板中間點植接種。將其在（28±2） ℃、85 % ?RH條件下置于霉菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d，觀察菌落的生長情況和形態(tài)特征，并用佳能700D相機拍照，根據(jù)《真菌鑒定手冊》? [13] 進行初步鑒定。

1.2.3 顯微鏡形態(tài)觀察

采用透明膠帶鏡檢法? [14] 。吸取適量乳酸石炭酸棉藍染液于載玻片，用無菌鑷子夾住膠帶兩端，使透明膠帶呈U字形，保持膠面朝下觸碰菌落表面，將粘有菌絲體的部分浸入載玻片上的染色液中，在超景深三維數(shù)碼顯微鏡下觀察霉菌的菌絲形態(tài)和孢子形狀。

1.2.4 PCR擴增及測序

霉菌屬于真菌微生物，因此本文選用引物ITSl（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）? [9-10，15]? 進行ITS片段擴增。其中PCR反應體系為 50 μL ，共包含35.5 μL水，1 μL模板引物，1 μL引物ITS1， 1 μL引 物ITS4，1 μL dNTP 10 mM，5 μL Taq Buffer，5 μL MgCl 2 25 mM，0.5 μL Taq酶5 U/μL。PCR反應條件設置：在95 ℃時預變性3 min，94 ℃時變性20 s，50～60 ℃時退火 20 s，72 ℃時 延伸20～50 s，總共循環(huán)35次，在72 ℃時修復延伸5 min。得到的PCR擴增產(chǎn)物在150 V、100 mA條件下用1 % 瓊脂糖進行20 min電泳。天霖生物科技（上海）有限公司對樣品進行序列測定。

1.2.5 序列分析

將序列結果輸入NCBI的核酸序列數(shù)據(jù)庫，使用在線序列比對搜索工具BLAST進行同源性比對分析，選取與比對菌株序列同源性超過99 % 且已知分類地位的真菌菌株? [16-17] ，確定霉菌種名。使用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，通過Neighbor- Joining進行聚類計算，使用Bootstrap檢驗系統(tǒng)進化樹的分枝可信度，自舉檢驗次數(shù)為1 000? [10] 。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學分析

在PDA培養(yǎng)基上對霉變棉織物中的微生物進行劃線分離與純化，觀察霉菌菌落的生長狀況、表面高度、菌落邊緣形狀和菌落顏色等，并在超景深顯微鏡的不同放大倍數(shù)下觀察霉變微生物的菌絲有無橫隔，分生孢子的形狀、分生孢子梗和頂囊等個體形狀? [14] ，初步確定為5種霉菌，依次編號為A、B、C、D和E。（28±2） ℃、85 % ?RH條件下，將5種霉菌接種到PDA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察霉菌的生長情況。A霉菌生長初期無色，4～5 d后菌落慢慢變成黃色。B霉菌生長初期為白色，生長過程中菌落顏色逐漸變灰，成熟后呈灰綠色。C霉菌在生長過程中產(chǎn)生大量滲透液，使得培養(yǎng)基呈淺褐色，與其他培養(yǎng)基差異比較明顯。D霉菌在PDA培養(yǎng)基上迅速繁殖生長，48 h后出現(xiàn)白色的直立菌絲，生長后期菌絲頂端長出圓形的黑色孢子。E菌落在培養(yǎng)基上快速蔓延生長，氣生菌絲呈厚絨狀，表面生成黑色的孢子。5種霉變微生物菌落形態(tài)、個體形態(tài)描述及初步鑒定結果如表1所示。

5種霉菌生長7 d后的菌落形態(tài)如圖1所示，霉菌個體形態(tài)（×1 000倍）如圖2所示。通過對菌落形態(tài)和微生物個體形態(tài)的分析，初步鑒定菌種A、C和E為曲霉屬霉菌，B為青霉屬霉菌，D為根霉屬霉菌。由形態(tài)學鑒定結果可知，曲霉屬真菌為3株，占比60 % ，為棉織物致霉的優(yōu)勢菌屬。

2.2 18S rDNA-ITS序列分析鑒定

根據(jù)天霖生物科技（上海）有限公司的測序結果，將得到的序列按照1.2.5的方法進行比對分析鑒定霉菌微生物種類，鑒定結果如表2所示，提交序列與數(shù)據(jù)庫中參照序列的同源性大于99 % ，可視為同一種? [16] 。因此，A、B、C、D、E分別為謝瓦式曲霉、指狀青霉、聚曲多霉、米根霉和黑曲霉。

在MEGA7.0中構建5種霉菌18S rDNA-ITS序列的系統(tǒng)進化樹，采用1.2.5中的方法進行距離分析，并檢驗其可信度，來評估系統(tǒng)進化樹的分枝可信度。由圖3可知，系統(tǒng)進化樹的自展值均超過50，表明構建的系統(tǒng)進化樹可信。5種霉變微生物的ITS序列聚類出3個分支，分別為青霉屬、曲霉屬和根霉屬，同種屬的霉菌進化關系近，獲得較高的支持率，合并在同一分支。

3 結 論

本文采用PDA培養(yǎng)基劃線分離純化霉變棉織物上的霉菌，并利用形態(tài)學方法和ITS序列分析完成棉織物致霉優(yōu)勢菌屬的鑒別，該方法具有可行性，能為紡織品致霉微生物的鑒定提供參考。分離純化的霉菌通過單菌落形態(tài)特征初步鑒定出5種霉變微生物，其中3種霉菌屬于曲霉屬霉菌，1種屬于青霉屬霉菌，1種屬于根霉屬霉菌， 曲霉屬霉菌占比60 % ，為棉織物致霉的優(yōu)勢菌屬。本文通過序列分析和同源性比較鑒定為5個種，分別為謝瓦式曲霉、指狀青霉、聚曲多霉、米根霉和黑曲霉。根據(jù)紡織品上微生物種類及其生理生化特征，可選擇合適的存儲環(huán)境和防霉整理劑，從而抑制霉菌生長，延長紡織品的使用壽命。

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Isolation， purification and identification of moldy microorganisms on textiles

TAO Yafei? 1a ， ZHANG Yuan 2， ZHOU Chunhao 2， HU Yun? 1b ， SUN Fubao? 1b ， LIU Jianli? 1a

（1a.College of Textile Science and Engineering; 1b.School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China; 2.Wuxi Little Swan Electric Co.， Ltd.， Wuxi 214122， China）

?Abstract：

During the wearing process， clothing will be contaminated by microorganisms from the human skin together with sebaceous lipids， sweat， and dead skin cells， which serve as a source of microbial nutrition. Therefore， clothing is easily contaminated by microorganisms in the air in the environment of daily life and is prone to mildew in warm and humid climate. The invasion of microbes in textile materials is mainly due to the presence of fungi. The growth of mildew on textiles has a series of effects not only on the textile itself but also on the wearer because mildew can secrete enzymes to decompose cotton， wool， and silk containing carbon， sulfur， and other nutrient sources into nutrients to promote their rapid reproduction and growth. At the same time， the mold will secrete organic acids and pigments during the growth process， causing acid corrosion and discoloration to the textiles， affecting their mechanical properties and aesthetics， and shortening the service life of the textiles. Therefore， it is necessary to identify the kinds of mildew on textiles， and adopt corresponding physical and chemical methods to inhibit their growth on the surface of the fabric according to the physiological and biochemical characteristics of these microorganisms， protect the textiles， and extend their service life.

In this experiment， mildew microorganisms were extracted from moldy cotton fabrics. Then， they were separated and purified by streaking on the PDA culture medium suitable for mildew growth， and a single bacterial strain was obtained. Microbial morphology was used for preliminary identification， and the gene sequencing identification of mildew microorganisms was completed through ITS sequence analysis. The moldy cotton fabric was collected from the real environment， and the mold-causing microorganisms were isolated and purified from the above. The mildew was identified through microbial morphology and ITS sequence analysis， and the species of mildew and the dominant fungi causing the mildew of cotton fabric were determined， providing a scientific basis for preventing mildew and inhibiting the growth of mildew. Among the isolated and purified mildew， five moldy microorganisms were initially identified based on the morphological characteristics of a single colony， in which three （60 % ） belonged to the genus ?Aspergillus ， one belonged to the genus ?Penicillium ， and one belonged to the genus ?Rhizopus . ?Aspergillus ?is the dominant genus of mildew-causing cotton fabrics. Five species were identified by sequence analysis and homology comparison， namely， ?Aspergillus chevalieri ， ?Penicillium digitatum ， ?Aspergillus sydowii ， ?Rhizopus oryzae ， and ?Aspergillus niger .

Clarifying the types of microorganisms that cause mildew in textiles can help people to choose suitable storage environment and anti-mold finishing agent in accordance with their physiological and biochemical characteristics， so as to inhibit mildew growth and prolong the service life of textiles.

Key words：

cotton fabric; mildew; morphology; sequence analysis; purification and identification

3162501186558