自身免疫性腦炎患者外周血濾泡輔助性T淋巴細胞升高的臨床研究

張運偉，喻 明，李琳林

(遂寧市中心醫(yī)院神經(jīng)三病區(qū)，四川 遂寧 629000)

自身免疫性腦炎(AE)是一種由異常的致病性自身抗體的產(chǎn)生從而介導引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，被認為是腦炎最常見的原因之一[1]。目前發(fā)現(xiàn)的AE抗N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是AE最常見的一種類型，通常與畸胎瘤相關(guān)；所有AE患者往往病情較重，且臨床表現(xiàn)多種多樣，嚴重時甚至危及患者的生命安全，由于自身抗體介導的病情復雜，疾病發(fā)展的預估性差[2]。由于機體免疫系統(tǒng)功能受到抑制，大腦中神經(jīng)細胞被損傷，AE患者出現(xiàn)記憶認知功能、運動障礙、癲癇等精神癥狀[3]。當腦部器官受到破壞及毒素的侵襲時腦部組織及神經(jīng)細胞表現(xiàn)為腦實質(zhì)減少、炎癥狀態(tài)，繼而導致全身臟器被感染破壞[4]。但因該病發(fā)病隱匿，且臨床癥狀比較廣泛，可用于診斷的檢查較少，不利于AE患者的早期診斷[5]。濾泡輔助性T淋巴細胞(Tfh)可能存在于淋巴組織B淋巴細胞區(qū)生發(fā)中心中的CD4+T淋巴細胞亞群，高表達趨化因子受體5(CXCR5)[6]。很多研究表明，在所有自身免疫性疾病(包括AE)的發(fā)生、發(fā)展中作為輔助B淋巴細胞的T淋巴細胞亞群Tfh 的過度活化與增殖可能是該類疾病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。為探討患者外周血Tfh百分比對AE患者的臨床意義，本研究回顧性分析了本院收治的35例AE抗體陽性患者的臨床資料，其中5例為抗富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活蛋白1(LGI1)抗體陽性患者，6例為抗γ-氨基丁酸受體(GABAR)抗體陽性患者，7例為抗α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體(AMPAR)抗體陽性患者，17例為抗NMDAR抗體陽性患者，探討了Tfh檢測對AE患者的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2018年1月至2020年12月本院收治的AE抗體陽性患者35例，其中男15例，女20例；年齡23～76歲，平均(52.23±8.33)歲；已婚22例，未婚13例。根據(jù)患者是否使用激素和免疫抑制劑治療分為未治療組(12例)和治療組(23例)。另外選擇同期健康體檢者20例作為對照組。按照改良RANKIN量表(MRS)評分將治療組患者分為治療后緩解組(治療后 MRS 評分下降至40分，15例)和治療后未緩解組(治療后 MRS 評分大于50分，8例)。

1.1.2納入標準[7](1)符合AE診斷標準；(2)簽署本研究知情同意書。

1.1.3排除標準[8](1)神經(jīng)類疾病；(2)依從性差，不配合治療；(3)患有肝臟、心臟、腎臟等嚴重疾病；(4)對照組排除各種自身免疫性疾病等。

1.2方法

1.2.1Tfh檢測

1.2.1.1分離外周血單個核細胞 采集各組研究對象靜脈血4 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，再取同外周血體積相等的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，混合均勻后取4 mL淋巴細胞分離液，將混合均勻的外周血與緩沖液混合液緩慢加到淋巴分離液上，3 000 r/min離心30 min后將分離后中間的單個核細胞層吸取備用。其次使提取的單個核細胞被四色熒光標記，通過流式洗液使單個核細胞被洗滌2次，加入檢測T淋巴細胞CD3+抗體、檢測白細胞分化抗原CD4抗體、抗程序性死亡受體1抗體、高表達趨化因子受體5抗原提呈細胞后在室溫下孵育30 min后通過流式洗液，并再洗滌單個核細胞2次，洗滌后進行重懸。然后進行流式細胞分析，被四色熒光標記后的單個核細胞在流式細胞儀的作用下使不同顏色之間的重疊區(qū)被單色補償管調(diào)節(jié)，對熒光強度值結(jié)果進行分析。

1.2.1.2免疫熒光染色 (1)制備大鼠腦片，用4%多聚甲醛對大鼠進行灌注，灌注后剝?nèi)〈笫竽X組織，高滲蔗糖脫水后再冰凍腦組織，對被冷凍的腦組織進行切片處理。(2)免疫熒光染色，取AE抗體陽性患者腦脊液與大鼠腦片在44 ℃下共同孵育，孵育12 h后用磷酸鹽緩沖液進行洗滌，加入二抗(Ab-cam 試劑盒)后避光孵育2 h后復染。

1.2.2觀察指標 觀察各組研究對象外周血單個核細胞Tfh百分比，以及 Tfh百分比與患者病情的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對象Tfh百分比比較 未治療組患者外周血 Tfh百分比[(26.08±3.05)%]明顯高于對照組[(5.83±1.93)%]，治療組患者外周血 Tfh百分比[(14.68±2.85)%]明顯低于未治療組。3組研究對象Tfh百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=2.073，P<0.05)。

2.2Tfh百分比與患者病情的相關(guān)性 治療后未緩解組患者外周血Tfh百分比[(28.98±3.24)%]明顯高于對照組，治療后緩解組患者外周血 Tfh百分比[(6.98±2.68)%]明顯低于治療后未緩解組。3組研究對象Tfh百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=1.799，P<0.05)；治療后緩解組患者Tfh百分比與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.176，P>0.05)。治療后外周Tfh百分比與AE患者病情評分呈負相關(guān)(P<0.05)。

2.3免疫熒光染色結(jié)果 將AE抗體陽性患者腦脊液與大鼠腦切片共同孵育染色結(jié)果為陽性。各型抗體陽性結(jié)果見圖1。

圖1 各型抗體陽性結(jié)果

3 討 論

Tfh屬于位于淋巴濾泡生發(fā)中心區(qū)的一種CD4+T淋巴細胞亞群，需要CXCR5受體和B淋巴細胞趨化因子13配體，高表達B淋巴細胞淋巴瘤因子6[9]。Tfh可促進B淋巴細胞活化，可參與自身免疫性疾病的任何階段[10]。體液中的免疫細胞與B淋巴細胞相互作用并發(fā)生免疫應答，從而充分發(fā)揮免疫細胞的作用。

近年來，自身免疫性疾病發(fā)病率逐年升高，自身免疫性疾病患者體內(nèi)均存在Tfh異常升高。自身反應性B淋巴細胞參與了淋巴濾泡生發(fā)中心反應，最終導致致病性自身抗體的形成，由此導致疾病的發(fā)生[11]。目前發(fā)現(xiàn)，Tfh參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[12-13]。

由于AE患者病因復雜，臨床癥狀也較廣泛，并無特異性指征[14]。目前，主要通過檢測外周血和腦脊液抗體，以及腦電圖、核磁共振檢查等手段進行診斷。早期診斷并給予有效的治療可在一定程度上提高患者生存率。對AE患者進行快速、有效的診斷成為巨大的挑戰(zhàn)。一直以來，人們也在積極探索AE的生物標志物，以便實現(xiàn)快速、高效的診斷。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦脊液顆粒蛋白前體是早期抗NMDAR腦炎的潛在生物標志物[15]。此外，近年來，越來越多的自身免疫相關(guān)性腦炎抗體被發(fā)現(xiàn)，如細胞表面抗體(NMDAR、GABAAR、GABABR、AMPAR、富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活蛋白1、調(diào)節(jié)亞單位二肽基肽酶樣蛋白、接觸蛋白相關(guān)蛋白-2、抗神經(jīng)元表面抗體介導的tau蛋白、代謝型谷氨酸受體5型、甘氨酸受體、多巴胺D2受體、突觸蛋白-3α抗體)、細胞內(nèi)抗體(抗神經(jīng)元抗體I型、谷氨酸脫羧酶、坍塌反應調(diào)節(jié)蛋白抗體)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞抗體(水通道蛋白4、髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體)等。為尋找AE的生物標志物開辟了新的路徑，但還是未能進行高靈敏度的預測。隨著抗體種類的增多，其檢測費用明顯增加，此外，抗體陰性AE患者具有AE的臨床表現(xiàn)，免疫治療具有一定療效，但自身免疫抗體呈陰性。究其原因，疾病早期抗原暴露有限，抗體滴度較低，難以檢出。故需尋找一種簡單、有效的檢測方式。

為探索AE的可能發(fā)病機制，本研究通過流式細胞術(shù)檢測了Tfh在AE抗體陽性患者外周血的表達情況，結(jié)果顯示，未治療組患者Tfh百分比明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明AE患者Tfh出現(xiàn)了異常增殖。而對經(jīng)過免疫治療的患者進行研究發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀未緩解的患者Tfh百分比明顯高于對照組，經(jīng)過規(guī)范化治療后的患者外周血Tfh百分比明顯低于未治療組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，治療后外周Tfh百分比與AE患者病情評分呈負相關(guān)，表明檢測外周Tfh百分比可在一定程度上預測AE患者的病情，對改善患者預后具有極為重要的作用。

目前，關(guān)于AE的具體病理機制尚不完全清楚。流行病學資料表明，AE發(fā)病率極低，約為13.7/100 000[16]。因此，對尋求這種患病率極低卻能很好地指示疾病的發(fā)生、發(fā)展的一種生物標志物很有必要。本研究結(jié)果顯示，AE患者外周血Tfh百分比可輔助臨床診斷，并對病情進行有效的預測，具有較高的臨床意義。此外，該項檢測方法操作性強，所受的限制條件較少，具有較高的安全性，并且操作簡單，檢查過程中所需時間較短，經(jīng)濟成本也較低，適宜廣泛開展。