外源酶提高鐵觀音殺青葉香氣的工藝研究

張 峰，薛婉茹，陳小明，謝李玲，李 斌，孟 春，郭松斌，謝金棟*，洪 晶*

1. 福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，福建 廈門 361022；2. 福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108

茶葉香氣由各種香氣成分以不同比例組合形成，是決定茶葉品質(zhì)的重要因素之一。茶葉中的香氣成分含量低、組分復(fù)雜以及易揮發(fā)等特點(diǎn)，使其不易提取和分離[1]。盡管如此，茶葉中香氣物質(zhì)具有潛在的抗腫瘤和抑菌效果[2]，還可作為香料添加在食品中，因而香氣物質(zhì)的提取與研究具有重要的意義。

鐵觀音是閩南烏龍茶的典型代表，具有獨(dú)特的花果香味[3]。有研究表明，不同的茶葉加工工序中，香氣成分的種類和含量也有較大變化，其中殺青葉含有的清香物質(zhì)更多，含水量更低[4-5]，更適宜用作香料研究。不同提取方法也會(huì)直接影響香氣成分的定性和定量分析[6]，適宜的鐵觀音殺青葉的提取分離工藝，有利于富集香氣成分，提高得率。相關(guān)研究表明，鐵觀音香氣成分以前體形式存在于茶鮮葉中，其在自身存在的一些關(guān)鍵酶作用下釋放出香氣成分。纖維素酶、果膠酶[7]以及漆酶[8]等可解構(gòu)茶葉細(xì)胞壁，大幅度提高有效成分的提取率，多用于速溶茶的加工。因而，外源酶的加入對(duì)于香氣物質(zhì)的釋放具有重要的意義。β-半乳糖苷酶[9]和β-櫻草糖苷酶等可將茶葉中的糖苷類前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為香氣成分；同時(shí)，有研究表明在茶葉香氣物質(zhì)提取過程中加入外源酶可顯著改善茶葉品質(zhì)[10]。

為了進(jìn)一步提高鐵觀音殺青葉中香氣物質(zhì)的提取率，降低生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)研究針對(duì)鐵觀音殺青葉中香氣成分含量低微及易揮發(fā)等問題，采用先酸解再酶解的方式對(duì)鐵觀音殺青葉的增香工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過GC-MS對(duì)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的成分和含量進(jìn)行分析和感官評(píng)定，為提高鐵觀音殺青葉中揮發(fā)性香氣成分得率提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵觀音春茶茶鮮葉的殺青葉（福建安溪）。檸檬酸、乙醇、氯化鈉，均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；內(nèi)標(biāo)物：2-辛醇，色譜純（純度99%，阿拉丁試劑有限責(zé)任公司）；卷煙（福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司七匹狼卷煙）。

Agilent 7890A-5995C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；Supleco固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國(guó)Supelco公司；Agilent HP-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱，美國(guó)安捷倫公司；SHA-C水浴恒溫震蕩器，國(guó)華企業(yè)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 鐵觀音殺青葉加酶酶解

水提法單酶酶解：采用水提法對(duì)茶葉進(jìn)行提取，具體方法為：5.0 g茶樣+100 mL去離子水，調(diào)pH值至5.0 → 加入生物酶 → 放入水浴鍋 50℃水浴震蕩 2 h → 冷卻后過濾 → 濾液定容到100 mL，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。加入的生物酶為α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、漆酶和風(fēng)味蛋白酶，添加量為0.3%。

水蒸氣蒸餾復(fù)合酶酶解：采用水蒸氣蒸餾法對(duì)茶葉進(jìn)行提取，具體方法為：5.0 g茶樣+100 mL去離子水 → 加入檸檬酸調(diào)pH值至3.0→ 放入水浴恒溫震蕩器 50℃水浴 30 min → 冷卻至室溫，將pH值調(diào)至5.0 → 加入復(fù)合酶 →放入水浴鍋50℃水浴震蕩2 h →冷卻至室溫，進(jìn)行水蒸氣蒸餾 → 餾出液定容至100 mL，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，復(fù)合酶添加量為0.3%。

1.2.2 GC-MS分析

SPME 萃取頭前處理：取樣前，固相微萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口于250℃老化30 min。

HS-SPME萃取過程：取提取后樣品6 mL于頂空瓶中，加入 10 μL 2-辛醇（10mg/L）和2.0 g氯化鈉，密封。放入恒溫加熱磁力攪拌器（60℃）平衡15 min，插入已經(jīng)老化的萃取針，頂空吸附45 min，于氣相色譜進(jìn)樣口處在250℃條件下解析5 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱，Agilent HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度為250℃；升溫程序：初始柱溫40℃，保持5 min，以5℃/min升至240℃，保持 5 min，后運(yùn)行時(shí)間 5 min；載氣，He（純度＞99.999%），柱流量1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

MS條件：電離源：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；質(zhì)譜四極桿溫度：150℃；質(zhì)量掃描范圍：35 ～ 450 m/z。

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

定性：將GC-MS檢測(cè)的物質(zhì)與NIST.11 library 進(jìn)行相似度匹配、特征峰分析，保留相似度大于70的化合物，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)檢出成分進(jìn)行定性分析。

定量：以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物，利用被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物（2-辛醇）面積比值計(jì)算茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量[11]。

統(tǒng)計(jì)分析：通過Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并使用GraphPad Prism進(jìn)行顯著性分析和多重比較。

1.2.4 鐵觀音茶香提取物在卷煙中的感官評(píng)定

挑選質(zhì)量和吸阻均勻一致的空白參比卷煙樣品，用香精注射儀將鐵觀音殺青物的提取物注入空白卷煙中，每種提取物添加7 μL/支，添加比例為1%，由福建中煙專業(yè)評(píng)吸小組進(jìn)行感官評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物酶對(duì)香氣物質(zhì)提取的影響

為了全面篩選不同的生物酶對(duì)鐵觀音殺青葉香氣物質(zhì)提取率的影響，試驗(yàn)選擇β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、漆酶、風(fēng)味蛋白酶、纖維素酶和果膠酶對(duì)鐵觀音殺青葉進(jìn)行酶解后水提，并測(cè)定不同酶酶解后樣品中香氣物質(zhì)含量變化，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖1可看出，與空白樣品相比，加入β-葡萄糖苷酶后的香氣物質(zhì)含量變化不大；而加入α-半乳糖苷酶后醇類和醛類香氣物質(zhì)有所減少，酯類物質(zhì)增加，總量有所增加，但增量較小；加入風(fēng)味蛋白酶后香氣物質(zhì)含量反而降低，可能是由于一些香氣物質(zhì)被水解；加入復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶）后醇類及酯類物質(zhì)都有所增加，總量也明顯增加（20%）；而加入漆酶后所有種類的揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量都增加，總量也有較大增加（51%）。

圖1 不同生物酶酶解后揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量對(duì)比圖Figure 1 Comparison of volatile aroma compounds content after enzymatic hydrolysis by different biological enzymes

苗愛青等用GC-MS與GC/Olfactometry相結(jié)合發(fā)現(xiàn)鐵觀音主要香氣成分是芳樟醇、水楊酸甲酯、己酸-順-3-己烯酯和α-法尼烯[12]；張方舟等分析發(fā)現(xiàn)，鐵觀音的主要香氣成分是橙花叔醇、吲哚、α-法尼烯、苯甲醛、爐紫羅酮、茉莉酮、香葉醇、(Z)-3-己烯酸乙煤、茉莉內(nèi)酯和芳樟醇等[13]； 但在鐵觀音殺青葉中芳樟醇、α-法尼烯、水楊酸甲酯、吲哚、香葉醇、順橙花叔醇、苯乙醛等物質(zhì)含量較高；與鐵觀音茶葉相比，鐵觀音殺青葉的主要香氣物質(zhì)組成類似。

本試驗(yàn)以鐵觀音殺青葉中的芳樟醇、香葉醇和苯乙醇作為主要香氣物質(zhì)進(jìn)行增香工藝研究。從圖2可看出，單獨(dú)加入α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶以及風(fēng)味蛋白酶并沒有增加主要香氣物質(zhì)的得率；而加入復(fù)合酶（纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶）后，芳樟醇、苯乙醇和香葉醇含量有增加，但增量不大（分別為3%、10%和15%）。加入漆酶后，三種主要的香氣物質(zhì)的得率都有較大幅度的增加（分別為22%、83%和150%）；但漆酶酶解后的樣品較為渾濁，可能是由于所用的漆酶為復(fù)合酶，其中所含的氧化酶使樣品發(fā)生氧化而渾濁。

圖2 不同生物酶酶解后主要香氣物質(zhì)含量對(duì)比圖Figure 2 Content comparison of main aroma substances after enzymatic hydrolysis by different biological enzymes

2.2 不同生物酶酶解樣品感官品質(zhì)

為了更好地確定不同生物酶酶解樣品中香氣種類及含量的變化對(duì)感官品質(zhì)的影響，采用感官評(píng)定方法對(duì)2.1中的6個(gè)樣品進(jìn)行評(píng)吸（表1）。評(píng)定結(jié)果認(rèn)為3#β-葡萄糖苷復(fù)合酶和4#α-半乳糖酶各有特點(diǎn)，其酶解后得到的香氣物質(zhì)更適合加入卷煙中。

表1 不同生物酶酶解樣品感官品質(zhì)評(píng)定結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of enzymatic hydrolysis samples with different biological enzymes

2.3 復(fù)合酶處理對(duì)香氣物質(zhì)提取的影響

將不同的生物酶與纖維素酶和果膠酶進(jìn)行復(fù)配，進(jìn)一步研究復(fù)合酶組成對(duì)鐵觀音殺青葉香氣物質(zhì)提取的影響。采用水蒸氣蒸餾法提取鐵觀音殺青葉中的香氣成分，結(jié)果如圖3和圖4所示。從揮發(fā)香氣物質(zhì)的種類及含量看，加入α-半乳糖苷酶復(fù)合酶后，酯類物質(zhì)增加明顯，其他物質(zhì)略有增加；加入β-葡萄糖苷酶復(fù)合酶后，醇類物質(zhì)增加較多；加入漆酶復(fù)合酶后，酯類、醛類和酮類物質(zhì)均有增加，醇類物質(zhì)降低，總量增加；加入漆酶和α-半乳糖苷酶復(fù)合酶后，兩者相互影響，不能起到效果疊加作用；而加入漆酶和β-葡萄糖苷酶后，所有種類的揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量都有增加，總量也有較大增加，且與單獨(dú)加入兩酶相比，復(fù)合加入兩酶具有效果增強(qiáng)的作用。

在酸性條件下，茶葉中的前體物質(zhì)更容易釋放出香氣物質(zhì)[14]。為考察加酸加酶工藝對(duì)香氣物質(zhì)提取的影響，試驗(yàn)采用先酸解再加入復(fù)合酶酶解以提高鐵觀音殺青葉香氣物質(zhì)的得率。從結(jié)果可看出，先酸解再酶解后，所有類型的香氣物質(zhì)、香氣物質(zhì)總量以及三種主要香氣物質(zhì)（芳樟醇、香葉醇和苯乙醇）含量均有增加（圖3、圖4），香氣總量提升48%，其中醇類物質(zhì)在酸解加酶解復(fù)合工藝下增長(zhǎng)116%，其中芳樟醇增長(zhǎng)61%、香葉醇增長(zhǎng)63%、酯類增加59%，還新增了具有強(qiáng)烈甜果仁香氣的α-甲基芐基乙酸酯、有水果香的甲酸己酯和新鮮青草香氣的苯甲酸葉醇酯等物質(zhì)。有研究表明，茶葉中存在著香氣化合物的前體，這些前體在外源酶的作用下釋放出香氣物質(zhì)[14]。在纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶復(fù)合酶以及酸解加酶解的作用下，芳樟醇、香葉醇和苯乙醇的含量大幅度增加，說明鐵觀音殺青葉中存在著這些香氣物質(zhì)的前體，經(jīng)過酸解以及酶解的作用，可以釋放出香氣物質(zhì)。試驗(yàn)處理的香氣物質(zhì)種類和相對(duì)含量如表2所示。

表2 復(fù)合酶酶解和酸解加復(fù)合酶酶解樣品香氣物質(zhì)含量Table 2 Contents of aroma substances in blank samples, complex enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis combined with complex enzymatic hydrolysis

圖3 水蒸氣蒸餾法不同生物酶酶解工藝揮發(fā)性香氣成分含量Figure 3 Comparison of volatile aroma components in different enzymatic hydrolysis processes by steam distillation

圖4 水蒸氣蒸餾法不同復(fù)合酶解工藝主要香氣物質(zhì)含量Figure 4 Content of main aroma substances in different complex enzymatic hydrolysis processes by steam distillation

2.4 復(fù)合酶酶解處理感官品質(zhì)

為了更好地確定不同樣品制備方法中香氣種類及含量變化對(duì)感官品質(zhì)的影響，采用感官評(píng)定方法對(duì)復(fù)合酶酶解所得到的7個(gè)樣品進(jìn)行評(píng)吸。將2.3中的樣品分為4組分別進(jìn)行評(píng)定。從表3可看出，酸解加復(fù)合酶酶解樣品加入卷煙中感官評(píng)定效果最好，與GC-MS測(cè)定的香氣物質(zhì)含量結(jié)果一致，酸解加復(fù)合酶酶解的香氣物質(zhì)含量最高。

表3 空白、復(fù)合酶酶解和酸解加復(fù)合酶酶解樣品感官評(píng)定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of blank, compound enzymatic hydrolysis and acidolysis combined with compound enzymatic hydrolysis samples

續(xù)表

續(xù)表

3 結(jié)論

香氣作為茶葉感官品質(zhì)表現(xiàn)的一個(gè)重要指標(biāo)，其形成、提取以及檢測(cè)分析等都成為茶葉品質(zhì)研究的熱點(diǎn)。本文以鐵觀音茶鮮葉的殺青葉為試驗(yàn)原料，以揮發(fā)性香氣物質(zhì)的相對(duì)含量和感官評(píng)吸結(jié)果為指標(biāo)，研究了不同加工工藝對(duì)香氣物質(zhì)提取的影響。結(jié)果表明，水蒸氣蒸餾方法得到的餾出物茶香凸顯，有甜感。在外源酶的篩選中，加入纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶復(fù)合酶處理的香氣物質(zhì)總量明顯增加，同時(shí)特征香氣物質(zhì)（芳樟醇、苯乙醇和香葉醇）含量也有明顯增加，且加入β-葡萄糖苷復(fù)合酶后茶香特征保留較好，煙氣細(xì)柔有質(zhì)感，有甜感且味道明亮，表明加入纖維素酶和果膠酶能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)茶葉中香氣成分的擴(kuò)散和浸出。在提取工藝上，酶解之前先進(jìn)行酸解，能在短時(shí)間內(nèi)釋放大量香氣物質(zhì)，增加香氣濃度；與加酶酶解樣品對(duì)比，香氣物質(zhì)總量顯著提高，且新增多種具有花果香的酯類物質(zhì)。本試驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于鐵觀音茶鮮葉殺青葉中香氣物質(zhì)的提取具有重要指導(dǎo)意義。