免疫親和凈化-高效液相質(zhì)譜法檢測茯磚茶中黃曲霉毒素B1

祖 新，燕 妮，郭嬌嬌，楊雅珺，焦成瑾

1. 甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030；2. 天水師院學院 生物工程與技術(shù)學院，甘肅 天水 741001

茯磚茶屬于我國六大茶類中的黑茶類，是獨具特色的一種全發(fā)酵茶。茯磚茶有別于其他茶種的關(guān)鍵在于加工過程中的“發(fā)花”工藝，其實質(zhì)是通過控制一定的外界條件促使茶葉中的微生物優(yōu)勢菌——冠突散囊菌生長繁殖，產(chǎn)生金黃色的閉囊殼即“金花”，提高發(fā)酵茶的活性成分[1]。黃曲霉菌與冠突散囊菌都屬于真菌且菌落形態(tài)非常相似，其次生代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知致癌性最強的一種化學物質(zhì)，是食品安全重點監(jiān)控的物質(zhì)，加之國內(nèi)外部分文獻報道發(fā)酵茶檢出AFB1[2-4]，繼而引發(fā)茯磚茶中黃曲霉菌污染的擔憂。

雖然技術(shù)先進的AFB1檢測方法不斷被開發(fā)，如基于納米技術(shù)的電化學方法[5-6]和基于光學傳感器原理的熒光分子探針法[7-8]等，但現(xiàn)階段最具實際使用價值的AFB1檢測方法是高效液相色譜 -質(zhì)譜法（High performance liquid chromatography mass spectrometer, HPLC-MS）。HPLC-MS法可同時對多種毒素進行定性和定量檢測，具有檢出限低、定量準確以及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是先進可靠的大型儀器分析技術(shù)。

茶葉基質(zhì)復雜，樣品前處理效果對結(jié)果影響很大，如ELISA分析方法，由于茶多酚在茯磚茶發(fā)酵過程中經(jīng)酶催化氧化縮合為茶黃素、茶紅素及茶褐素等物質(zhì)，具有縮合單寧的性質(zhì)，從而嚴重影響AFB1的檢測[9-10]。為了發(fā)揮HPLC-MS精確可靠的技術(shù)優(yōu)勢，選取恰當?shù)那疤幚矸椒ㄊ侵匾h(huán)節(jié)；免疫親和凈化是先進的前處理方法，可實現(xiàn)AFB1的提純凈化，大幅減少茶基質(zhì)的干擾[11]。本文對免疫親和凈化-HPLC-MS方法檢測茯磚茶中AFB1的有效性予以驗證，為該類茶葉的安全生產(chǎn)以及消費采購提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

市場出售的茯磚茶20份：H1 ～ H9產(chǎn)地湖南，S1 ～ S6 產(chǎn)地陜西，G1 ～ G3 產(chǎn)地貴州，B1～ B2 產(chǎn)地湖北。

1.1.2 主要試劑

黃曲霉毒素免疫親和柱（IAC Column，貨號：10001963，規(guī)格：3 mL，美國Romer Labs公司），色 譜 柱：ACQUITY UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。乙腈、甲醇均為色譜純。標準品：黃曲霉毒素B1標物（3 mg/L，貨號：CDAA-S-290028-JH-1mL，上海安譜）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（液相Exion LC130，質(zhì)譜5500 Q-trap，美國AB SCIEX公司）、正壓固相萃取儀（PPM48，美國J2 Scientific公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品提取

稱取0.5 g試樣于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇-水溶液（70∶30），渦旋混勻，在6 000 r/min 下離心 10 min，取上清液備用。質(zhì)控樣品：以甲醇-水溶液（70∶30）為溶劑，準確配制AFB1標液，濃度分別為75 ng/mL和105 ng/mL。

1.2.2 免疫親和柱凈化

首先配制1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉、0.20 g 磷酸二氫鉀和 0.20 g 氯化鉀，用 900 mL水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1，加水稀釋至 1 000 mL，取 10 mL 吐溫 -20，用該溶液稀釋至1 000 mL，即為1%吐溫-20的PBS。

準確移取 4 mL 上清液，加入 23 mL 1% 吐溫-20的PBS，混勻。將低溫下保存的免疫親和柱恢復至室溫，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至50 mL注射器筒中，控制樣液以 1 ～ 3 mL/min 的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入2×10 mL水，淋洗免疫親和柱。待水滴完后加入2×1 mL甲醇洗脫親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入1 mL流動相，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

1.2.3 基質(zhì)效應檢測

測定 1.0 ～ 30.0 ng/mL 濃度范圍的茯磚茶基質(zhì)提取液（1∶50）工作液和甲醇溶劑工作液，建立各自的校準曲線，基質(zhì)效應相對強度（matrix effect,ME,%） =［(基質(zhì)匹配校準曲線的斜率/溶劑校準曲線的斜率)-1］×100。

1.2.4 方法回收率與精密度測定

在空白樣品基質(zhì)中分別加入4種不同濃度的AFB1標準品，按相同步驟作樣品提取和免疫親和柱凈化，加標濃度分別為2、5、10、20 μg/kg，每個濃度進行6次重復實驗，計算回收率和相對標準偏差。

1.2.5 高效液相色譜儀條件

流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈 -甲醇溶液（50∶50），洗脫梯度為0 ～ 5.5 min：28% ～ 35%B，5.6 ～ 7.0 min：90%B，7.1 ～13.0 min：28%B。流速為 0.6 mL/min，進樣量為 5 μL，柱溫為 30℃。

1.2.6 三重四級桿質(zhì)譜儀離子源參數(shù)

條件ESI+，離子源溫度550℃，噴霧電壓5500 V，氣簾氣 35 psi，噴霧氣 (N2)55 psi，輔助加熱氣60 psi，去簇電壓80 V；化合物參數(shù)：母離子313.2，定量離子285，碰撞能量30 V，定性離子241碰撞能量50 V。

2 結(jié)果與分析

基質(zhì)效應測試結(jié)果如表1所示，基質(zhì)效應趨勢一致，計算AFB1基質(zhì)效應相對強度ME為66%，基質(zhì)效應較強，表明采用免疫親和柱凈化的茯磚茶基質(zhì)對AFB1檢測結(jié)果影響依然較大，為削弱基質(zhì)效應，后續(xù)標線建立采用基質(zhì)溶劑。

表1 基質(zhì)效應測試數(shù)據(jù)表Table 1 Matrix effect Matrix effect test data table

HPLC-MS標準品檢測線性關(guān)系良好，y = 858x + 528，相關(guān)系數(shù)0.9993，以信噪比S / N ≥ 3 確定檢出限計算出該方法檢出限為0.03 μg/kg，加標濃度 2 ～ 20 μg/kg 時，回收率為87.5% ～ 90.1%，相對標準偏差 ＜ 6.0%，結(jié)果見表2，顯示方法精密度較高。工作曲線見圖2，標準溶液總離子流圖見圖3，樣品檢測數(shù)據(jù)峰見表3。

表2 加標回收率及精密度Table 2 Spiked recovery and precision

表3 液相色譜-質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)峰表Table 3 Data detected by liquid chromatography-mass spectrometry

圖2 黃曲霉毒素B1液質(zhì)標準曲線Figure 2 Standard curve of AFB1 by HPLC-MS

圖3 黃曲霉毒素B1標品液質(zhì)總離子流圖Figure 3 Total ion current chromatogram of AFB1 standard

結(jié)果表明：盡管具有較強的基質(zhì)效應，采用免疫親和柱凈化的高效液相質(zhì)譜法仍然具有較高的回收率、精密度及分析檢測限，適用于茯磚茶中AFB1的檢測。HPLC-MS結(jié)果顯示，本次檢測的20份茯磚茶樣品均未檢出AFB1。

3 討論

茯磚茶是否容易被真菌污染持續(xù)受到行業(yè)的關(guān)注，Xu[12]分析了茯磚茶發(fā)酵與貯藏過程中的真菌群落，從表型和基因?qū)用骅b定出冠突散囊菌為茯磚茶優(yōu)勢菌種。Zhao[13]研究表明，冠突散囊菌能產(chǎn)生多種抗真菌化合物來抑制黃曲霉的徑向生長，不但對黃曲霉菌產(chǎn)毒具有抑制作用，還可促進AFB1的有效降解。Daryanavard[14]研究顯示，以谷氨酸、精氨酸、組氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸為配體的鋅（II）配合物對黃曲霉菌具有抑制效果，從而減少AFB1的產(chǎn)生；茯磚茶富含鋅和多種氨基酸[15-16]，應該具有天然的黃曲霉菌抑制能力。Lu[17]通過跨膜雙向轉(zhuǎn)運實驗和動物實驗表明，氧化茶多酚（OTP）與AFB1可以復合，并對AFB1的吸收有抑制作用。Ye[18]對包括茯磚茶在內(nèi)的黑茶中多種真菌毒素飲食風險進行了概率評估，其中黃曲霉毒素95%致癌風險的最大值為2.12×10-8，遠低于可接受的致癌風險水平（10-6）。以上這些研究表明，正常生產(chǎn)和儲存條件下茯磚茶的AFB1暴露處于較低水平，AFB1污染所導致的食品安全風險很低。