miRNA在乙型肝炎病毒及相關疾病中作用機制的研究進展

王 蔚，張麗麗，趙 川，王欣茹，張 會，尹有美

（泰州市人民醫院 肝病科，江蘇 泰州 225300）

乙型肝炎病毒（HBV）可以引起急性或慢性肝臟疾病，盡管目前有有效的疫苗，它仍是一個主要的全球健康問題。HBV發現于1966年，它是一種小的、有包膜的病毒，具有肝病毒科的部分雙鏈DNA基因組。HBV已經影響了世界人口的三分之一，其中超過3.5 億人患有慢性乙肝[2]。慢性乙型肝炎（CHB）患者肝小葉的結構被破壞，肝細胞再生結節增多，最終可發展為肝纖維化。肝臟的纖維化經常在不知不覺中進展，特別是在那些HBV攜帶者中發生，激活的免疫系統加速了肝纖維化的進展。HBV 感染是慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌（HCC）的關鍵風險因素。HBV 并不會直接損害肝細胞，HBV 感染造成的肝損害主要是由于宿主的免疫反應引起的。乙型肝炎的免疫發病機理取決于宿主因素（如年齡、性別、免疫狀態），病毒和環境因素的錯綜復雜的相互作用。

微小RNA（miRNA）發現于1993年，是由19～23個核苷酸組成的非編碼小RNA，主要通過配對靶轉錄物的3' 非編碼區調控真核生物的基因表達。到目前為止，已發現超過2000 個人的miRNAs，大約60%的人mRNA 可成為miRNA 的靶標。miRNA 參與多種生理和病理功能，其中包括免疫應答和腫瘤發生。除此之外，miRNA是許多病毒-宿主相互作用的重要調節劑。越來越多的研究證實了多種病毒的復制可能受到不同的miRNA 的影響，包括皰疹、多瘤病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒等。成熟的miRNA 是一種在進化中高度保守的非編碼小分子RNA。目前，在人類基因組中發現的成熟miRNA 分子已達2000 多種，調控著人類大約超過30%的蛋白質編碼基因。盡管部分miRNA可以促進病毒復制，但某些miRNA 可以用作潛在的抗病毒劑。在這方面，艾滋病毒、HCV（丙型肝炎病毒）和HBV（乙型肝炎病毒）已進行了廣泛的研究。由于復雜的生命周期和復雜的宿主反應，miRNA 在HBV 生物學中的作用是多方面的。HBV調節細胞miRNA的表達以增加其自身復制并從免疫應答中逃逸，并在感染的肝細胞中建立病毒的持續性增殖。通過HBV相關的信號調節途徑如免疫應答、凋亡、增殖和遷移可以導致miRNA的失調表達。最近的研究發現，細胞外miRNA 能夠在血清中循環，并且這些miRNA 是高度穩定的，這被認為可以在HBV的診斷與治療中起到積極的作用。研究表明，一些宿主miRNA 可以通過多種方式調節HBV復制，某些miRNA直接靶向病毒RNA阻止其復制，也有miRNA靶向特異性宿主基因阻礙病毒繁殖，甚至某些miRNA 能夠激活特異性免疫應答以抑制病毒。Dai 等[1]的研究表明miRNA-15b 通過人肝細胞核因子1α 激活HBV 增強子I 促進HBV 的復制，而HBx 的表達抑制了miRNA-15b 的表達。HBx 蛋白可調控抑癌基因miRNA-145、miRNA-21 和miRNA-222 的 表 達。也 有 研 究 表 明miR-98， miR-375， miR-335，miR-199a-5p 和miR-22 參與HBV 的復制與表達，并促進HCC 的發生與發展[2]。Sarkar[3]發現在乙型肝炎感染期間，miRNA-155的表達與Toll樣受體7的表達正相關。此外，miRNA-34a 靶向CCL22 并通過調節T 細胞抑制HBV 感染。而miRNA-146a和miRNA-548 分別靶向STAT1 和IFN-λ1 以促進HBV感染。

1 miRNA的生物功能

1.1 miRNA 的生物發生細胞核中由RNA 聚合酶II 和III 轉錄的初級miRNA 被核糖核酸酶Drosha-DGCR8 復合物切除，并產生前體miRNA。這些前體miRNA通過Ran-GTP及蛋白-5轉運至細胞質，并被稱為Dicer 的RNAse III 酶切除，產生miRNA 雙鏈體。這種雙鏈體繼而分裂產生單鏈成熟miRNA 最終形成RNA 誘導的復合物（RISC）。RISC 和Argonaute/ EIF2C（AGO）蛋白共同作用促進靶mRNA 識別。miRNA 識別靶mRNA 是通過miRNA 的5' 端（種子序列）和編碼區和非翻譯區（UTR），特別是mRNA 的3’-UTR 中位點之間的特異性堿基配對的相互作用。成熟的miRNA 通過靶基因序列抑制轉錄機制或誘導mRNA降解。

1.2 miRNA 的特征miRNA 基因在核內由RNA聚合酶II 轉錄成大約7000nt的初級微小RNA(primiRNA)，pri-miRNA 再經由核內的Drosha 酶及蛋白DGCR8識別，切割成長約70～80nt的miRNA前體（pre-miRNA），然后，其被轉運蛋白（expor?tin5） 轉運至胞質，在Dicer 酶（核酸內切酶Rnase Ⅲ）的作用下，進一步將pre-miRNA 切割成了22 個nt 的雙鏈miRNA，其被解旋酶解旋以后，其中的一條鏈成為成熟miRNA。近來研究表明，miRNA 的表達具有時間特異性及組織特異性，其對基因的調控非常復雜，往往不是一對一的關系，一個miRNA 可能調控了數百個靶基因的表達，而一個靶基因也有可能由多個miRNA 共同調控，數量眾多的miRNA與其不同的靶基因之間形成了一個錯綜復雜的基因表達調控網絡。換句話說，如果miRNA 和靶mRNA 之間存在部分互補，其將導致轉錄的阻遏，而如果存在完全互補性，將導致靶mRNA 的降解。由miRNA 促進的mRNA 降解是通過誘導去腺苷酸化或抑制蛋白質合成、抑制帽識別時的翻譯起始或誘導核糖體過早下降完成的。即使在細胞中生長停滯的情況下，成熟miRNA也可以增加靶基因的表達。

2 病毒miRNA與乙肝病毒研究的進展

2.1 miRNA和乙型肝炎X蛋白對宿主基因表達的調節雖然有許多病毒產生特定的miRNA 以操縱宿主的基因編碼，到目前為止還沒有證據證實HBV合成miRNA。有大量的研究認識到HBV調節不同的宿主miRNA，但只有少數確認了單個病毒蛋白在所述調節中的作用。有研究證實在所有病毒蛋白中，乙型肝炎X 蛋白（HBxAg）在調節宿主miRNA 中起到了特定功能，在HBx 表達細胞中上調7 個miRNA 并下調了11 個宿主miRNA。HBx靶向miRNA 的反向調節Ras，HMGA2，MYC 和STAT3的let-7家族（let-7a，let-7b和let-7c），可調節宿主腫瘤形成和免疫應答[4]。HBx蛋白也被發現具有上調miR-29a的作用，而miR-29a可反向增強肝癌細胞遷移。此外，HBx 可以下調miR-101，導致異常DNA 通過靶向DNA 甲基轉移酶3 甲基化[5]。此外，已經證實通過HBx蛋白上調的miRNA-146a可下調補體因子H并促進肝炎的進展[6]。

2.2 miRNA調節乙肝病毒復制宿主與病毒的相互作用是目前研究的熱點問題，而miRNA 在這種相互作用中起重要作用。到目前為止的多項研究證實，有大量的宿主miRNA 可以通過多種方式調節HBV復制，主要是抑制病毒復制。其中，某些miRNA 直接靶向病毒RNA 阻止其復制，也有miRNA 靶向特異性宿主基因阻礙病毒繁殖。甚至某些miRNA能夠激活特異性免疫應答以抑制病毒。

2.2.1 miRNA 直接抑制乙肝病毒復制 在病毒基因組中具有靶序列的miRNA 可以直接靶向并抑制HBV。在一項研究中，Wu 等人[7]應用計算分析以確定在HBV基因組中具有靶位點的miRNA，篩選出了靶向聚合酶和表面基因let-7，miR-196b，miR-433，miR-511等。也有其他研究證實了某些miRNA可直接抑制HBV復制，包括miR122（靶向mRNA 的編碼區、病毒聚合酶和HBV 基因組核心蛋白的3' -UTR 區）[8]，miR199a-3p（靶向HBsAg 編碼區），miR210（靶向HBV 前S1 區），miR125a-5p（與HBV 表面抗原相互作用并抑制其表達）[9]，miR15a（靶向HBx 轉錄物，miR20a，miR-92a-1，miR-16-1（HBV 轉 錄物）[10]和miR205（靶 向X 基因）[11]。

2.2.2 miRNA 間接抑制乙肝病毒復制 某些miRNA在HBV基因組中沒有直接結合位點但可以通過與其相關的其它宿主因子間接調節病毒復制、轉錄。在這方面，miR122已經被廣泛研究。它是肝特異性的miRNA，通過復雜信號網絡參與影響HBV感染。目前有些研究表明miR122增強病毒復制，而某些研究則發現其抑制病毒復制。例如，miR122通過靶向抑制血紅素加氧酶-1促進病毒復制。而miR122 亦通過靶向CyclinG1 和NDRG3 抑制病毒復制。miR-141 和miR155 可以通過直接靶向PPARα（過氧化物酶體增殖物激活受體α）和C/ EBP-β（CAAT 增強子結合蛋白β）有效抑制HBV 復制。miRNA-130a 通 過 靶 向 作為HBV 轉 錄增強子的PGC1α和PPAR抑制HBV的復制[12]。

2.2.3 miRNA促進乙肝病毒復制 值得注意的是，沒有確實的證據顯示宿主miRNA 可直接促進病毒。然而，有些實驗結果表明某些miRNA 可以增強病毒復制。例如，Dai 等人[1]的研究表明miR-15b 通過人肝細胞核因子1α 激活HBV 增強子I 促進HBV 的復制，而HBx 抑制miR-15b 的表達。也有研究結果顯示miR-146a和miR-548通過抑制特異性宿主免疫因子促進HBV復制[13]。

2.3 miRNA 與HBV 治療許多miRNA 可以抵抗HBV，但是沒有相關的臨床試驗。在這方面，最重要的是miRNA 的輸入，這是可能引起高度細胞毒性的。miR122，miR30和miR31已有相關研究。用于輸入miR122 和miR31 的體miR 樣序列的設計已經成功地實現了減少＞80%的病毒復制。需要關注的另一個重點是基于HBV感染的臨床階段的治療管理。miR-29b 模擬物預防肝纖維化，而miR-99a模擬物顯著抑制HCC期間的腫瘤生長。

3 miRNA與HBV感染的不同階段

HBV是具有復雜生命周期的非細胞病變病毒。有研究已經開始著眼于與HBV感染的不同階段相關的miRNA 的特異性作用。然而，這些研究的結果有時是矛盾的。值得注意的是肝臟疾病（慢性肝病，肝硬化和肝細胞癌）也可能由于多種其他感染如丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），甲型肝炎病毒（HAV），戊型肝炎病毒（HEV）和環境因素（例如，酒精性肝病等）引起，并且存在特異性的miRNA作用其中。

3.1 慢性肝炎越來越多的研究揭示了肝臟特異性miR122 與慢性肝病相關。研究表明miR122 在HBeAg 陽性慢性肝炎患者血液樣品中顯著上升。也有實驗顯示miR372/373 隨著HBV DNA 滴度的升高而上升，因此其可作為慢性肝炎的標志物。Chen 等 人 實 驗 表 明let-7c，miR23b，miR122 和miR150可以用于診斷隱匿性HBV感染。

3.2 肝硬化miR29 在所有與肝硬化相關的miRNA中廣為人知[8-12]。miR29與進展性肝硬化/纖維化及其程度呈負相關。肝硬化主要由于肝星狀細胞（HSC）分泌的膠原沉積在肝細胞的細胞外基質。有研究顯示miR29 通過TGF-β 和NF-κB 通路抑制HSC中的膠原分泌基因來抑制肝硬化/纖維化。miR133a 和miR199 在肝硬化/纖維化過程中下調，而miR181b，miR214-5p，miR221 和miR222 在肝硬化過程中上調并且因此可以充當標記物。

3.3 肝細胞癌HBV，特別是HBx 蛋白，可調節不同細胞miRNA 的表達并促進肝癌的發生。HBX蛋白促進miR-17-92 簇（mir-17-5p，miR-18a，miR-19a，miR-19b，miR-20a 和miR-92a-1）在HBV 相關的HCC 中升高。同樣的研究也發現miR21 在HBV 相 關 的HCC 升 高。Laderio 等 強 調HBV 相關HCC 與非HBV 相關的HCC 相比，miR-96 過表達。有研究表明miR155 在HBV 相關的HCC 中上調。HBx 蛋白可使miR-122 表達失調。HBx 可通過啟動子高甲基化誘導調節miR-205 和miR-132 的表達[14]。HBx 還通過抑制腫瘤抑制因子p53，減少miR-34，miR-23a，miR-148a，miR-192，miR-125b和miR-200的表達促進肝癌發生[15]。

4 miRNA多態性與HBV感染

miRNA 是基因功能的復雜調節物，miRNA 編碼基因中的單核苷酸多態性（SNP）可能與HBV持久的易感性相關，并因此與HCC 發展相關。在韓國病例對照研究中，Cheong 等[16]發現miR-604基因上的T 等位基因是HBV 相關慢性肝病患者HCC 發生的保護因素。他們也發現miR-219-1 啟動子中的T 等位基因與HBV 清除有強烈相關性。Yu 等人[17]發現microRNA-323b 多態性與乙型肝炎病毒的持續性相關，這種多態性促進病毒復制增強。Xiang 等[18]表明miR-499 多態性與HBV 相關HCC的易感性相關。Xu等人[19]的一項meta分析揭示了miRNA編碼基因中存在三個常見的功能性SNP，即miR-146a G→C （rs2910164），miR-196a-2C（rs11614913）和miR-499 T→C（rs3746444）。他們發現編碼miR-146a 和miR-196a-2 的基因中所含的SNP 可能在HCC 的遺傳易感性中起主要作用，miR-146a C 變異與HCC 風險降低有關。miR-196a-2T變體與高加索人群中HCC的易感性相關。Su等人[20]的研究也支持miR-146a多態性在亞洲人HBV相關HCC的遺傳易感性中可能發揮作用。

5 miRNA和宿主免疫應答

機體的免疫應答包括先天性固有免疫反應和后天性適應性免疫反應，兩者之間相輔相成，共同維護機體的免疫穩態。近年來研究表明，miRNA 不僅參與了免疫細胞的發育和分化，也在機體免疫應答調控機制中發揮了重要的作用，是一類新型的免疫調控分子。但是，有關miRNA在宿主對HBV免疫應答中的作用的研究很有限。Su等人[21]研究發現miR155 靶向SOCS1，通過JAK-STAT 通路增強針對HBV的抗病毒反應。也有研究發現在乙型肝炎感染期間，miR155的表達與Toll樣受體7的表達正相關。此外，miR-34a靶向CCL22并通過調節T細胞抑制HBV感染。而miR-146a和miR-548分別靶向STAT1和IFN-λ1以促進HBV感染。

6 結語

近年來，miRNA 對免疫反應的調控作用越來越受到關注，miRNA 被發現可作為基因功能的整體調節物。使用核苷類似物作為治療策略的限制性和沒有可用于反映HBV誘導的肝病階段的合適生物標志物已受到研究人員的長期關注。大規模研究揭示，有些miRNA 可以被病毒調節以促進病毒復制，而有些miRNA 可以抑制病毒的復制。miR-155參與針對HBV的免疫應答介導病毒抑制，并可以觸發細胞凋亡。也有研究[22]稱miR155 參與腫瘤形成，這需要在未來研究中進一步證實。此外，血液循環中的miRNA 可作為生物標志物，并用于確定HBV臨床階段。總而言之，有關miRNA的研究對HBV及其相關肝臟疾病的診斷與治療具有重要作用，具體機制有待進一步探索。