基于生物信息學分析UBE2C、TTK和CP 對卵巢癌預后的影響

馬惠涵 秘嘉慶 秦 倩 馬梅杰 馮勤梅

1.山西醫科大學第五臨床醫學院，山西太原 030001；2.山西醫科大學附屬人民醫院婦科，山西太原 030012

卵巢癌是婦科癌癥中導致女性死亡的主要原因。晚期卵巢癌患者5 年生存率不到20%，且多數患者會在18 個月的中位無進展生存期復發[1-2]。

轉錄異常的基因可作為癌癥的預后標志物，在臨床試驗中進行新藥研發和指導治療[3]。Leoutsakou等[4]使用半定量RT-PCR 方法發現SRA1 基因在卵巢腫瘤組織中高表達，Dong 等[5]將胰島素樣生長因子2確定為卵巢癌與卵巢組織的差異表達基因，Fu 等[6]通過蛋白質組學和轉錄組分析發現UTP23 的低表達促進了卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性，但因不穩定性和非適用性，目前尚鮮見報道可指導臨床的生物標志物。

本研究從NCBI 基因表達綜合數據庫下載數據集，利用R 軟件識別卵巢癌與正常對照間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEG），并進行功能富集分析。此外，建立DEG 和關鍵模塊的蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡并進行模塊分析、生存分析及相關性分析，最終發現3 個與卵巢癌預后相關的重要基因。

1 材料與方法

1.1 基因表達譜數據

基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）由美國國立生物技術信息中心創建，保存高通量功能基因組學數據。4 個數據集均出于此且已發表相關文獻。

1.2 微陣列數據集的綜合分析

基于編程語言R，使用hgu133plus2.db 注釋包和hgu133a.db 注釋包轉換基因名，使用limma 軟件包[7]識別出4 個數據集中卵巢癌組織與對照健康卵巢組織相比的DEG，用VennDiagram 軟件包[8]對DEG 進行整合。|logFC|＞1.5 和P ＜0.05 被認為對DEG 有統計學意義。logFC＞1.5 認為是上調DEG，logFC＜1.5 為下調DEG。

1.3 功能和途徑富集分析

使用Clusterprofiler 包對DEGS 進行功能和途徑富集分析，顯著閾值設定為P<0.05。基因本體論（gene ontology，GO）功能富集主要從細胞成分、生物過程和分子功能三方面描述基因和其產物的功能。京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑富集分析從基因的生化途徑和調控途徑等方面進行說明。

1.4 PPI 網絡構建和模塊篩選

使用數據庫STRING 映射DEG 以綜合得分≥0.4為截止值。Cytoscape 軟件[9]構建PPI 網絡，可視化分析卵巢癌中DEG 編碼蛋白間的相互作用并使用Cytohubba 鑒定出20 個hub 基因。同時用分子復合物檢測（molecular complex detection，MCODE）PPI 網絡的密集區域，選擇MCODE分數＞3 和節點數＞4 的模塊并對基因分別進行KEGG 富集分析。

1.5 中樞基因的生存分析

Kaplan-Meier Plotter 中有大量卵巢癌患者的臨床數據，可用于分析20 個hub 基因對存活的影響，選擇logrank P ＜0.05 的基因。

1.6 hub 基因表達水平分析

使用基因表達譜交互式分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）對影響預后的hub基因進行表達水平分析，設定P ＜0.01 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因表達譜數據

納入4 個數據集，共297 例卵巢癌樣本和32 例健康對照樣本（表1）。經limma 軟件包篩選出812、2820、1495 和536 個DEG（|logFC|＞1.5，P ＜0.05），通過VennDiagram 包進行基因整合。通過VennDiagram包對4 個數據集中的105 個DEGs 取交集。與正常卵巢組織比較，卵巢癌組織樣本中共有135 個DEG。見圖1。

表1 數據集的相關信息

2.2 富集分析

在編程語言R 中使用Clusterprofiler 包對DEG進行生物學注釋并得到P 值<0.05 的GO 功能富集。其顯著性結果表明：細胞組成中，上調DEG 主要富集在雙株緊密連接、后期促進復合物、頂端連接復合物及緊密連接中，下調DEG 主要富集在細胞外基質、含膠原的細胞外基質及血液微粒中；生物過程中，上調DEG 明顯富集在有絲分裂紡錘體組裝檢查點、染色體分離調控、細胞周期中后期轉變的調控和染色體分離等，下調DEG 明顯富集在蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調控、黏多糖代謝過程和Wnt 信號通路；分子功能中，下調DEG 主要在肝素結合及卷曲結合中富集，而上調DEG 未見符合標準的明顯富集。

2.3 PPI 網絡與模塊分析

經STRING 數據庫建立PPI 網絡并導入Cytoscape軟件。MCODE 檢測到4 個模塊，選擇分數較高模塊進行下一步分析（圖2）。使用Cytohubba 篩選hub 基因，前20 分別為KDR、SOX9、EPCAM、WNT5A、FGF13、PDGFRA、CP、ALDH1A1、KLF4、CDC20、UBE2C、FGF9、SOX17、TTK、TRIP13、CKS2、RACGAP1、CD24、CHGB、LAMB1。

2.4 KEGG 途徑富集模塊中的基因

經KEGG 富集分析后發現：模塊1 中均為上調DEG，主要在細胞周期、泛素介導蛋白水解作用途徑富集；模塊2 中除ALDH1A1 為下調DEG，余為上調DEG，未見明顯通路富集；模塊3 中除CP 為上調DEG，余為下調DEG，富集后CP 在鐵死亡、卟啉和葉綠素代謝途徑中存在，LAMB1 在ECM 受體相互作用、小細胞肺癌等途徑中存在。

2.5 hub 基因的生存分析和表達水平分析

在Kaplan Meier Plotter 中對20 個hub 基因進行生存分析，發現13 個基因關聯卵巢癌患者的預后較差（P ＜0.05）。使用GEPIA 進一步分析發現，卵巢癌樣本中有SOX9、EPCAM、CP、UBE2C、TTK、RACGAP1、CD24 7 個基因反映出高表達（P ＜0.01）。見圖3。

3 討論

為確定卵巢癌預后不良的重要基因，本研究采用生物信息學方法對GEO 數據庫的數據集進行整合分析。最終取交集得到UBE2C、TTK、CP 3 個基因在卵巢癌中高表達且影響預后，又顯著富集于KEGG 通路，將其認為是改善卵巢癌患者預后的有效靶點。

UBE2C 在細胞周期進程中促進目標蛋白降解，異常的UBE2C 過表達與異常的細胞增殖可能相關[14]。Wang 等[15]研究顯示UBE2C 在胃癌中高表達，敲低UBE2C 會通過Wnt/β-catenin 和PI3K/Akt 信號通路抑制胃癌腫瘤形成，將其定義為診斷胃癌潛在生物標志物。Yuan 等[16]構建基因共表達網絡鑒定出6 種與透明細胞腎細胞癌的進展和預后相關的hub 基因，其中包括UBE2C。Martínez-Canales 等[17]通過數據集轉錄組功能注釋和PPI 網絡分析確定UBE2C 基因的過表達與較差預后相關，和本研究一致。

TTK 的轉錄水平在細胞進入正常細胞周期中通過有絲分裂時被上調，后期被泛素E3 連接酶降解失活而下調，也就是TTK 的及時失活才能維持正常細胞周期進程[18]。Tang 等[19]使用加權共表達網絡分析確定TTK 可作為乳腺癌臨床研究的預后生物標志物，Zhang 等[20]從公開轉錄組數據發現高水平TTK 與大腸癌患者預后不良有關，Feng 等[21]使用與本研究不完全相同的GEO 數據集發現卵巢癌中4 個影響預后的顯著上調基因，其中包括TTK，間接驗證本研究的可靠性。

CP 基因編碼銅藍蛋白，血清中銅藍蛋白水平在炎癥和組織損傷中上調[22]。Arner 等[23]發現CP 在肥胖受試者的脂肪組織和與肥胖相關的癌細胞中過表達（如子宮內膜癌），將其確定為新型脂肪因子。通過定量實時RT-PCR 和Western blot 檢測肺腺癌臨床樣本，Matsuoka 等[24]發現CP 表達與較差預后顯著相關，將其作為肺腺癌的獨立預后因素。在卵巢癌中，患者血漿銅藍蛋白水平較對照組明顯增加，且其啟動子活性表現更明顯[25]。

總之，本研究通過對4 個不同數據集進行客觀的生物信息學分析，明確得到卵巢癌組織和健康對照樣本間的3 個DEG，其高表達與卵巢癌患者的預后不良呈正相關。總結和比較與之相關的大量文獻，本研究認為這3 個基因在卵巢癌的進程中可能起到關鍵作用，可作為新的預后生物標志物。這些數據都為卵巢癌的治療和改善患者預后提供有用的方向。但目前尚未進行實驗驗證，這也是未來進行深入研究的重點。