低氧條件下FGFR2在牦牛肺動脈平滑肌細胞中的表達

陳樹吾，姚一凡，張 蘭，劉翊中，鐘 文，喬自林，楊 琨*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

缺氧是誘發低氧性肺動脈高壓（HPH）最重要的病理因素，HPH主要發病環節為低氧性肺血管收縮反應（HPV）和低氧性肺血管重塑（HPVR）[1-2]。肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）的遷移和增殖可能會導致肺動脈血管重塑[3]。

牦牛一般生活在海拔3 000～5 000 m的區域。作為高原地區特有的牛種，牦牛肺臟微動脈中膜肌層厚度與血管直徑比例較小，肺動脈的構造不僅能促進氣體交換，還能預防肺動脈高壓[4]。

成纖維細胞生長因子受體2（Fibroblast growth factor receptors 2,FGFR2）是調節細胞生長和分化的重要分子和受體[5]。研究表明，在缺氧條件下，FGFR2會促進細胞的遷移和侵襲[6]，但截至目前，低氧引起FGFR2表達升高的信號通路還不是很清楚。本研究探討低氧條件PAMSCs對FGFR2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM/F12、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶溶液（蘭州百靈生物技術有限公司）、胎牛血清（gibco）、細胞培養瓶（Corning）、EVO M-MLV反轉錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）、TRIzolTMReagent（Thermo），2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（ABclonal)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 本試驗所選取的牦牛PASMCs是本課題組前期所分離并培養。將PASMCs從液氮中取出，放置于37 ℃溫水中快速搖晃直至完全融化，牦牛PASMCs在含有15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養基中，在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，完全貼壁后，轉移到37 ℃、1%O2、5%CO2低氧培養箱中培養，并開始計時。

1.2.2 細胞總RNA的提取 在低氧條件下培養6 h、12 h、24 h、48 h、60 h后，迅速棄掉細胞培養液，用PBS沖洗3遍，吸去參與PBS。加入2 ml TRIzol試劑，反復在細胞瓶中吹打，室溫放置5 min以徹底解離蛋白復合體。將混合物裝入2個無菌無RNA酶的1.5 ml PE管中，加入200 μl氯仿使其與TRIzol混勻，用力搖晃20 s，室溫靜置5 min，12 000×g，4 ℃ 離心，10 min，吸取上層水相到新的無菌無RNA酶PE管中，加入500 μl 100%異丙醇到水相中，室溫放置10 min用來沉淀RNA。12 000×g，4℃離心，5 min，棄沉淀，用DEPC水配制的1 ml 75%乙醇沖洗RNA沉淀。將乙醇中的RNA 7 500×g，4℃離心，5 min，然后吸去乙醇，室溫干燥RNA沉淀5～8 min。加入30～40 μl DEPC水溶解徹底RNA沉淀。用2 μl RNA測量所提RNA樣品A260/A280的OD值。

1.2.3 RNA樣品反轉錄 去除gDNA反應體系如表1所示。將樣品振蕩混勻后離心，再放入PCR儀中42 ℃ 2 min進行基因組DNA去除反應，然后低溫放置加入反轉錄試劑。反轉錄反應過程如表2所示，混勻離心后將樣品在PCR儀中37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s進行變性、退火反應，程序結束后將樣品存放于-20 ℃保存。

表1 去除gDNA反應體系

表2 反轉錄反應過程

1.2.4 Real Time PCR 利用Primer-BLAST根據目的基因FGFR2 Gene ID：102270743和ACTB Gene ID：102286048 設計所需要的引物（表3），并在湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。

表3 引物序列信息

利用ABclonal的2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix實時熒光定量對目的基因進行檢測。反應體系見表4，反應條件見表5。在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀中進行RT-qPCR反應，數值均用內參ACTB進行標準化。RT-qPCR結果采用2-ΔΔCt運算方法進行分析。利用GraphPad Prism 8分析目的基因的差異性。

表4 熒光定量PCR反應體系

表5 熒光定量PCR反應條件

2 結果與分析

2.1 牦牛肺動脈平滑肌細胞的復蘇與培養

將細胞培養48 h后置于顯微鏡下觀察，細胞形態清晰，生長狀態良好，可用于后續試驗（圖1）。

圖1 細胞培養結果

2.2 提取總RNA的純度分析

將提取的RNA進行純度分析，所有樣品OD值均在1.8～2.0之間，可用于后續試驗（表6）。

表6 樣品純度檢測

2.3 不同低氧時間PASMCs中FGFR2基因表達量分析

由圖2和圖3可知，擴增反應結束后，ACTB和FGFR2基因的擴增曲線在不同低氧時間PASMCs中均呈現完好的“S”形，斜率較高，拐點清晰，未出現雜亂條帶；溶解曲線均呈單峰，且Tm值附近無明顯雜峰，各樣本峰值接近，無雜亂帶，無引物二聚體，符合試驗要求。

圖2 ACTB基因的擴增曲線與溶解曲線

圖3 FGFR2基因的擴增曲線與溶解曲線

圖3 （續）

在不同低氧時間PASMCs中FGFR2的mRNA相對表達量在不同時間段有顯著變化（P＜0.01）。由圖4可知，FGFR2在常氧、低氧不同時間點6 h、12 h、24 h、48 h、60 h均有表達，在低氧6 h、12 h與常氧無明顯差別，24 h后FGFR2表達量開始增長，到48 h達到最高，60 h開始有所下降。

圖4 不同低氧時間PASMCs中FGFR2基因的表達情況

3 分析討論

肺動脈高壓（PAH）最重要的病理因素是缺氧，它能引起許多內源性細胞因子和活性物質的異常釋放，導致血管收縮和平滑肌細胞增殖[7]。缺氧明顯促進PASMCs增殖，慢性缺氧通過增強PASMC的增殖和收縮能力以及細胞內Ca2+（[Ca2+]i）水平來提高pH值[8]。

牦牛的肺在構造上和低海拔動物的肺不同。牦牛肺的血-空氣屏障比低海拔動物要薄，可促進氣體交換中氧的擴散[9]。以牦牛為突破口來研究低氧條件對肺動脈平滑肌的影響具有重要意義。本試驗通過對牦牛肺動脈平滑肌細胞進行不同時間低氧培養，觀察FGFR2基因表達情況，結果發現在低氧條件下，隨著時間的增長，FGFR2 mRNA表達量逐漸增加。這說明PAMSC在低氧情況下是FGFR2產生的一個重要來源。同時，低氧刺激FGFR2表達增加可能是通過FGFR2基因轉錄的調控達到的。成纖維細胞生長因子一族具有調節細胞增殖和分化功能的活性多肽，它們在腫瘤發生與轉移、創傷愈合等病理情況下具有重要意義。有研究表明，慢性低氧時，FGFR2參與了肺血管收縮及血管結構重構[10]。

4 結論

試驗發現，FGFR2基因在牦牛肺動脈平滑肌細胞低氧培養中隨著時間的增長，其表達量呈遞增趨勢。與相關文獻結合進行分析，FGFR2基因在牦牛肺動脈平滑肌細胞低氧適應過程中起著重要作用，未來有望成為抗低氧環境的相關基因，但其作用的具體分子機制尚不明，有待進一步研究。